Thermo-Scientific-RevertAid-First-Strand-cDNA-Synthesis-Kit-K1621说明书第一链cDNA合成试剂盒.docxVIP

Page  PAGE 10 RevertAid?第一链cDNA Synthesis试剂盒 #K1621, #K1622 分析证明书 #K1621 Lot  质量控制  采用100 fg对照GAPDH RNA和对照引物进行RT-PCR反应，通过在1%琼脂糖上进行凝胶电泳和溴 化乙锭染色显示得到足够量的496 bp的产物 质量认证人：Jurgita Zilinskiene 目录 页码 试剂盒组成…………………………………………………………….2 存储条件……………………………………………………………….2 产品说明……………………………………………………………….2 注意事项……………………………………………………………3 操作步骤……………………………………………………………6 RT-PCR…………………………………………………………….6 合成cDNA用于克隆………..………………………………………7 实验对照……………………………………………………………….8 问题分析与解决……………………………………………………...10 试剂盒成分 RevertAid?第一链cDNA合成试剂盒20 次 #K1621100 次 #K1622RevertAid? M-MuLV反转录酶（200 u*/μl）25 μl120 μlRiboLock? RNA酶抑制剂 (20 u**/μl)25 μl120 μl5×反应缓冲液 （250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 250 mM KCl, 20 mM MgCl2, 50 mM DTT） 150 μl 500 μl10mM dNTP 混合物50 μl250 μlOligo(dT)18 引物 100 μM, 0.5 μg/μl (15 A260 u/ml)25 μl120 μl随机六聚体引物 100 μM, 0.2 μg/μl (6 A260 u/ml)25 μl120 μlGAPDH正向引物, 10 μM 5’ – CAAGGTCATCCATGACAACTTTG – 3’ 20 μl 20 μlGAPDH反向引物, 10 μM 5’ – GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG - 3’ 20 μl 20 μl对照GAPDH RNA 1.3 kb 3’-poly(A) tailed RNA transcript, 0.05 μg/μl 20 μl 20 μl无核酸酶高纯度水2x1.25 ml2x1.25 ml* 一个单位的RevertAid?M-MLV逆转录酶在37℃10 分钟将1 nmol 的dTMP转化为多核苷酸组分（吸附在DE81上）。 ** 一个单位的RiboLock?RNase酶抑制剂抑制5ng RNA酶A 50%的活性。 存储条件 试剂盒中所有组分应存储在-20°C。对照用RNA可存储于-70°C以便长期使用。 产品说明 RevertAid?第一链cDNA合成试剂盒以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA。本试剂 盒使用RevertAid? M-MuLV反转录酶，它的RNA酶H的活性与AMV反转录酶相比较低。该反转录酶可 耐受42-50°C温度，合成的cDNA片段长度达13kb。 试剂盒中含有RiboLock? 重组RNA酶抑制剂，防止RNA降解，可耐受55°C高温。 试剂盒同时含有oligo(dT)18和随机六聚体引物。随机六聚体引物与模板非特异性地结合，以总RNA 中任何RNA为模板合成cDNA。oligo(dT)18选择性和RNA 3’poly(A)配对结合，只以有poly(A)尾巴的 mRNA为模板合成cDNA。使用本试剂盒也可采用序列特异性引物。 合成的第一链cDNA能直接用作PCR或荧光定量PCR的模板，第二链cDNA的合成或线性RNA扩增， 也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验，比如将标记好的第一链cDNA 作为杂交实验中的探针或者用于微阵列分析。 注意事项 避免核酸酶污染 RNA的纯度和完整性对于合成全长cDNA至关重要。RNA很容易被RNA酶A降解，而RNA酶A广泛 稳定地存在于实验室中。试剂盒中的所有成分都经过了无RNA酶的严格验证并保证不含有RNA酶。为 防止污染，实验室和所有实验准备工作都必须保证没有RNA酶污染。 避免RNA酶污染的常规建议： ● 用DEPC处理实验用到的所有管子和枪头，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具。 ● 整个实验过程戴手套，因为皮肤是RNA酶的一个常见来源。并经常更换手套。 ● 使用无RNA酶的试剂，即使是超纯水也要确保无RNA酶（比如#R0581，无RNA酶的高纯度水）