激光扫描共聚焦显微镜技术-0429.ppt

2、共焦显微镜发展历史 1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利 1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面 1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学 1984年，Biorad为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描 1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统 1987年White和Amos在英国《自然》杂志发表了“共聚焦显微镜时代的到来”一文，标志着LSCM已成为进行科学研究的重要工具 3、显微镜成像清晰度的决定因素: 1）.分辨率2）.球差3）.色差 1）、分辨率： 指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用显微镜所能分辨清楚最近的相邻两点间的距离来表示。 人眼及各类显微镜的分辨率 人眼分辨率： 0.20 mm 光学显微镜分辨率： 0.25 mm 共焦显微镜分辨率： 0.18 mm 电子显微镜分辨率： 0.20 nm 4、激光扫描共聚焦显微镜基本结构 激光扫描共聚焦显微镜系统主要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等 激光共聚焦显微镜构成 （1）扫描模块 扫描模块主要由针孔光栏（控制光学切片的厚度）、分光镜（按波长改变光线传播方向）、发射荧光分色器（选择一定波长范围的光进行检测）、检测器（光电倍增管）组成。荧光样品中的混合荧光进入扫描器，经过检测针孔光栏、分光镜和分色器选择后，被分成各单色荧光，分别在不同的荧光通道进行检测并形成相应的共焦图象，同时在计算机屏幕上可以显示几个并列的单色荧光图象及其合成图象 （2）荧光显微镜系统 显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。显微镜光路以无限远光学系统可方便地在其中插人光学选件而不影响成像质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜，有利于荧光的采集和成像的清晰。物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制 激光扫描共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特点：需与扫描器连接，使激光能进入显微镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检测器；需有光路转换装置，即汞灯与激光转换，同时汞灯光线强度可调 （3）常用激光器 激光扫描共聚焦显微镜使用的激光光源有单激光和多激光系统，常用的激光器包括以下三种类型 : 半导体激光器：405nm（近紫外谱线 氩离子激光器：457nm、477nm、488nm、514nm（蓝绿光 ) 氦氖激光器：543nm（绿光-氦氖绿激光器）633nm （红光—氦氖红激光器 ) UV激光器（紫外激光器）：351 nm、364 nm（紫外光 ) 基本工作原理 激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理是首先由激光器发射的一定波长的激发光，光线经放大后通过扫描器内的照明针孔光栏形成点光源，由物镜聚焦于样品的焦平面上，样品上相应的被照射点受激发而发射出的荧光，通过检测孔光栏后，到达检测器，并成像于计算机监视屏上。这样由焦平面上样品的的每一点的荧光图像组成了一幅完整的共焦图像，称为光切片  5、共焦显微镜与传统显微镜的区别 1）.抑制图像的模糊，获得清晰的图像 2）. 具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片 3）. 增加侧向分辨率  4）. 由于点对点扫描去除了杂散光的影响  1）.点照明 2）.具有照明pinhole和探测pinhole 3）.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面 4）.具有扫描系统—— 逐点扫描成像 5）.具有多个（四个） 荧光通道，可同时探测多个被标记物 1）. xy分辨率比传统显微镜小1.4x 传统显微镜: Rxy=0.61?/NA （0.25 ?m ) Confocal: Rxy=0.4?/NA（0.18 ?m ) 2）. 样品的最大厚度: 取决于: 物镜的NA、物镜的工作距离 激光的穿透力、样品的透明度 Z轴的最大移动范围(166?m、Z-wide) 3）. 样品的最小光切厚度: (载物台最小移动距离为40nm） 取决于: 物镜的NA、针孔大小 Z轴的最小移动步距: 40nm Z轴