杜鹃花叶片总RNA的改良CTAB法提取论文.docVIP

　　杜鹃花叶片总RNA的改良CTAB法提取论文 郭秀莲，张正银，田萍，罗绍银，白洁，庄平 【摘要】 目的研究杜鹃花叶片总RNA的提取方法。方法一种适合富含次生代谢产物的杜鹃花叶片总RNA的提取方法——改良CTAB法。采用CTAB作为去污剂，分别用氯仿和水饱和酚反复抽提以及高浓度NaCl沉淀，以去除蛋白质、多糖和次生代谢物等杂质.freelethod for isolation of total RNA from Rhododendron leaf. MethodsAn improved CTAB method Rhododendron leaf , a plant etabolites. Using chemical CTAB as detergent in the extraction buffer, the absolute ethanol precipitation of RNA ed finally after removing of proteins, polysaccharides, and secondary metabolites by subsequent chloroform, H2O-saturated phenol extraction and high concentration NaCl precipitation, respectively.ResultsThe yielded total RNA had integrality and high purity but. Conclusion The method may be applied to some difficult RNA extraction plants full of polyphenol and polysaccharides, particularly Rhododendron. Key proved CTAB Method 杜鹃花叶片中的蛋白质、多糖、多酚等次生物质含量多且复杂，严重影响了其RNA的提取质量，从而给此类植物的基因工程研究带来了诸多阻碍。由于多糖类胶状物质会严重堵塞过滤柱，所以即使使用商业提取试剂盒也不能得到高质量的RNA；另外，这类次生代谢物含量多的材料，市售的RNA提取试剂的针对性也不强，不仅操作麻烦费时，而且很难同时解决RNA的质量和得率问题。虽然目前已建立了很多针对富含多糖多酚材料的RNA提取方法［1～5］，但还没有以杜鹃花为材料提取RNA的报道。因此，本实验以杜鹃花叶片为材料，借鉴CTAB法［6］并进行了改良，提出一套适合提取杜鹃花叶片总RNA方法。 1 材料与仪器 1.1 试剂与仪器提取液配方：2%CTAB(AGING SYSTEM(SYNGENE)；紫外可见分光光度计：TU-1800(北京普析通用仪器有限责任公司)；PCR 仪：Personalcycler (Biometra 公司)。 1.2 材料多年生杜鹃花叶片采自龙池华西亚高山杜鹃园，采下后立即用液氮浇淋，于-70 ℃贮存备用。 2 方法 2.1 几种试剂盒法提取杜鹃花叶片总RNARNA plant试剂提取法：试剂购自TIANGEN公司，实验操作按照说明书进行；TRI Reagent 试剂提取法：试剂购自Ambion公司，实验操作按照说明书进行；RNeasy Plant Mini Kit试剂提取法：试剂购自QIAGEN公司，试验操作按照说明书进行。 2.2 改良CTAB法提取程序：①称取100 mg的杜鹃花叶片，迅速放入液氮研磨至粉末状，转入1.5 ml离心管内，加入65℃预热的0.75ml提取液，涡旋振荡混匀后65℃温浴20 min。②加入与提取液等体积的水饱和酚，振荡摇匀，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10min。③上清转入新的无RNase离心管；加入与提取液等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)混匀，4℃，12 000 r·min-1离心10 min。④吸上清装入新的离心管里，加入1/2上清体积5 mol·L-1 NaCl，摇晃混匀，再加入1/2体积氯仿，振荡混匀，4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min。⑤上清液转入新的无RNase离心管并加入等体积的异丙醇，温和混匀后室温放置10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，小心倒掉上清液；加入1 ml 70%乙醇，4 ℃ 12 000 r·min-1离心1 min，小心倒掉上清液；加入30～50 μl DEPC处理水溶解沉淀。⑥加入DNase I(10 U·μl-1)1 μl混匀，37℃温浴30 min。⑦加入100 μl DEPC处理水稀释后，再加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次 ，4℃，12 000 r·min