凝集反应-elisa.pptVIP

* 无菌采血，离心2000rpm,3min，取上清作为待测标本 每孔加入酶结合物1滴，37℃孵育30min 反应板中加入待测标本，同时设阴性、阳性、空白对照孔(NS) （反应板已用纯化HBsAg包被 ） 手工洗板，弃液拍干，重复5次 每孔加入显色剂A液、B液各1滴，置37℃孵育15分钟 每孔加入终止液1滴，混匀 目测法：与阳性和阴性对照比较，观察颜色深浅判断结果 【步骤】 * * * 免 疫 学 实 验 课贵阳医学院免疫学教研室 * 1、试管凝集反应（示教） 2、ABO血型鉴定--玻片凝集反应（1份/1人） 3、类风湿因子检测--乳胶凝集实验（示教） 4、乙型肝炎病毒表面抗体检测--ELISA法(1份/1人） 实 验 内 容 * 实验二 凝 集 反 应（Agglutination） * 实验原理 颗粒性抗原（细菌、细胞等）与相应的抗体，或可溶性抗原/抗体吸附于与免疫无关的载体，形成致敏颗粒，与相应抗体/抗原在一定的条件下，形成肉眼可见凝集小块的反应，称为凝集反应。参与反应的抗原称凝集原（agglutinogen），抗体称为凝集素（agglutinin）。 * 凝集反应类型 直接凝集反应（direct agglutination） 颗粒性抗原与相应抗体直接结合，所出现的凝集现象，包括试管凝集反应、玻片凝集反应。 间接凝集反应 （indirect agglutination） 将可溶性抗原（或抗体）吸附在与免疫无关的载体颗粒表面，使此颗粒致敏（免疫球），然后再与相应抗体（或抗原）混合，在适当条件下，发生凝集现象，称为间接凝集反应或被动凝集反应。 * * 操作步骤 于试管架上列7支试管。 1.每管内分别加入生理盐水0.5ml。 2.血清稀释：第一管加入1:10待检血清0.5ml，混匀 后取0.5ml，加入第二管内，依此类推，直到第6管， 混匀后从第6管中吸出0.5ml弃去；第7管为对照管。 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml （一）试 管 凝 集 反 应 * 3.每管加伤寒杆菌“H” 抗原0.5ml。 4.混匀，置 52℃水浴4h，取出后，置 室温过夜，次日读取凝集效价。 * 结 果 观 察 不同程度的凝集现象： ＋＋＋＋：液体澄清，细菌全部凝集（100%），沉于管底形成 大片凝集物。 ＋＋＋：液体基本澄清，细菌大部分凝集（75%左右），管底的 凝集物稍小。 ＋＋： 液体半澄清，稍显浑浊（凝集物50%左右），但仍可见 明显凝集块。 －： 液体浑浊，无凝集块，轻摇试管，有细菌呈絮状浮起。 * 效价：抗原抗体反应时，发生明显反应的最高血清稀释度，又称滴度。 凝集效价：凝集反应时，能使50%或以上的抗原发生凝集的最高血清稀释度。 * （二）玻片凝集反应 已知抗血清与未知颗粒性抗原置于清洁玻片上，在一定的条件下，若两者相对应，则会发生凝集。本方法主要用于抗原的定性分析，如菌种鉴定、ABO血型鉴定等。 ABO血型系统 * * * ABO血型鉴定步骤 红细胞悬液的制备（用于血型鉴定及ELISA实验） 1.取EP管1支分装适量生理盐水 2.消毒耳垂或手指皮肤 3.用采血针采1-2滴血，加入盛有生理盐 水的EP管中混匀（待测抗原） 取已加有抗A血清与抗B血清载玻片1张，分别加入待测抗原各1滴，并用牙签混匀。 置室温5 分钟左右观察结果。 * * 注意事项 用牙签研磨时，注意防止将抗A血清带到抗 B血清中，反之亦然。 如果凝集现象不太明显时，可用显微镜观察。 * 类风湿因子（RF）的检测 RF是抗人变性IgG的IgM类抗体，将 变性IgG包被于乳胶颗粒上，此致敏乳胶颗粒与待测血清结合时，如血清中存在RF，即可出现凝集小块。 （三）乳胶凝集试验 * 操作步骤 1.在凝集反应板中取4孔分别加入阴性血清、 阳性血清、生理盐水、待检血清各1滴 2.每孔分别加入致敏胶乳1滴，充分混匀，置 室温５-10分钟观察结果。 * 免疫标记技术 将已知抗体或抗原标记上易示踪物质（如酶、荧光素、放射性同位素、胶