Affymetrix全转录本芯片实验流程.pdfVIP

Whole Transcript芯片实验流程简介 Wei Huang Field Application SSpecialist 简要流程 各个步骤所需时间 第一天 rRNA消减 1.5小时（仅针对Exon芯片） 第一次循环，cDNA合成 3小时 cRNA合成 16小时 第二天 第二次循环，DNA一链的合成、片段化及标记 8小时 杂交杂交 第第三天天 洗涤、染色和扫描 2小时 实验的起始 PolyA的参入 Gene Array RNA起始量 100ng～300ng Exon Array RNA起始量 1ug～2ug 根据操作手册中的比例，参入poly A 内标记 rRNA的消减和检测 针对Exon芯片片 使用Agilent BioAnalyzer 2100检测消减结果 消减后消减后RNA 的纯化的纯化 rRNA消减结果检测（Exon芯片） 第一次循环，cDNA一链的合成 加入含有T7 的随机引物 70度5分钟，4度至少2分钟 配制cDNA第一链合成试剂 2525度度1010分钟分钟，4242度度6060分钟分钟，7070度度1010分钟分钟，44度度22分钟分钟 第一次循环，cDNA二链的合成 氯化镁的稀释 二链合成体系的配制 16度120分钟（无热盖），75度10分钟（加热盖），4度2分钟。 cRNA的合成和纯化 1. cRNA合成体系的配制 2. 37度16小时（过夜）IVT 3. 第二天使用纯化柱纯化cRNA 4. 两次洗涤提高产量 5. Nanodrop测定浓度 6. -80度可保存 cDNA一链的合成 70度5分钟，25度5分钟，4度2分钟 255度度100分钟分钟，，42度度9090分钟分钟，，700度度100分钟分钟，，4度度2分钟分钟 cRNA的水解和DNA单链的纯化 1. 加入加入RNaseH 37度45分钟，95度5分钟，4度2分钟。 2. 使用试剂盒对DNA单链进行纯化 3. Nanodrop进行定量 4. -20度保存 DNA单链的片段化 DNA单链溶液配置 Frag体系配置 37度60分钟，93度2分钟，4度2分钟 BioAnalyzer 2100检测，-20度保存 DNA单链片段化结果检测 片段化后DNA单链的标记 37度60分钟，70度10分钟，4度2分钟 杂交体系的配置 杂交条件杂交条件 45度，60rpm，17±1小时 洗涤，染色和扫描 1. 采用Affymetrix洗涤染色试剂盒 2. 根据protocol，分装不同的染色液 3. 根据芯片类型，选择不同的洗涤程序 4. 洗涤和染色大致为90分钟 5. 根据芯片的不同，扫描时间不一 芯片质控和数据分析 1. 芯片扫描图片观测 2. 使用Expression Console进行QC 3. 选择其它软件进行高级数据分析 ThThe WWay AhAheadd.™™ ©2004 Affymetrix, Inc. All rights reserved