核素34.pptVIP

阳春砂辐射诱变及基于ISSR 的变异分析 主讲 35号吴锦灿 解答 34号谢德鑫 制作 33号李玉敏 目录 阳春砂 药用植物阳春砂( Amomum villosum Lour． ) 是 我国著名的“四大南药”之一砂仁的主要来源植 物，产于广东省阳春市的道地药材春砂仁具有很 高的经济价值，但由于长期无性繁殖造成品种退 化，导致道地产区的阳春砂产量徘徊不前，阳春砂 育种研究有待进行。 60 Co-γ 射线的应用 60 Co-γ 射线是辐射诱变育种最主要的诱变因子，在农作物育种和药用植物育种中都有广泛应用。组织培养材料繁殖系数高，且对辐射敏感，变异率高，将组织培养技术与辐射诱变技术结合应用可提高育种效率。 用组织培养结合辐射诱变的方法，加快阳春砂育种速度，培育阳春砂新种质，对于实现阳春砂的高产优质具有重要意义，但未见有相关研究报道。 ISSR 实验方法 组织培养 1.材料： 8 月中下旬收集的阳春砂成熟新鲜果实 2.药品： α-萘乙酸( NAA，naphthalene aceticacid) 、 6- 苄基腺嘌呤( 6-BA，6-benzylamino-purine) 3.种子培育无菌苗： 手工剥去果皮，取出种子，用湿沙磨去种子表面果肉，于自然条件下阴干，4℃保存备用。进行种子播种前的处理和培养，待种子发芽后，转入MS 培养基中继续培养，获得无菌苗。 4.不定芽诱导诱导 培养基以MS 为基本培养基，分别添加1～4mg /L 的6-BA、0. 1 或0. 2mg /L的NAA，以不添加任何激素的培养基为对照，均添加蔗糖30g /L、琼脂粉8g /L，pH 值为5. 8。经无菌操作将无菌苗带节茎基部( 约5mm) 切下，接种于诱导培养基上，每个处理接种20～40 个外植体。培养温度26 ± 2℃，光照强度1600lx，照光12h /d。培养50d 后统计最终出芽情况，不定芽诱导率=( 产生不定芽的外植体个数/总外植体个数) ×100% ; 出芽倍数= 不定芽总数/产生不定芽的外植体数。 5. 植株再生 培养50d 后，将已生根长叶的再生幼苗转入MS 培养基中，培养温度26 ± 2℃，光照强度1600lx，光照14h /d，培养约30d 后长成具7 片真叶以上的植株。开瓶炼苗2 ～ 3d 后移栽至育苗盆中。 60Co-γ 射线辐射诱变 1.辐射剂量 以60Co 为辐射源，剂量率为1.57Gy /min，预试验以4、8、12、16Gy 进行辐照，根据预试验结果，再设置3个剂量16、20、24Gy 进行辐照。 2.辐照方法 以长度小于10mm 的组培不定芽为材料进行辐照，以未经辐照而其余处理相同的组培不定芽为对照，每组12 个。辐照完毕后在添加3. 0mg /L 6-BA 和0. 1mg /L NAA 的MS 培养基中培养，培养条件同1. 1. 5。培养10d 后将不定芽转至MS 培养基中再生植株。辐射90d 后统计各辐照剂量组培不定芽再生幼苗的存活率和生根率，以不长根且茎叶俱黄记为死亡; 60Co-γ 射线辐射诱变 ISSR 分析 ISSR 分析 结果与分析 1、阳春砂组织培养不定芽的诱导及再生 阳春砂无菌苗带节茎基部在培养约4d 后开始出芽，约30d 后分化出1 ～ 4 个芽( 图1 ) 。 50d 后统计不同激素组合下的不定芽最终诱导率和出芽倍数，结果如图2 所示。 2、不定芽60Co-γ 射线辐射诱变 在16、20 和24Gy 3 个剂量组下，随着辐射剂量的提高，存活率和生根率呈下降趋势( 图3) 。 经γ 射线辐射的不定芽再生幼苗发生明显矮化， II 级矮化率随着辐射剂量的提高呈升高趋势( 图4) 。 不定芽辐射处理80d 后观察，对照组的植株平均高度达到9. 5cm，叶形正常、叶色浓绿且能正常生根，而16、20 和24Gy 处理过的不定芽大部分再生幼苗均出现了明显的植株矮化，同时还有叶片发黄卷曲、叶形不对称、生根受抑制等现象。部分幼苗如图5 所示。（A、B、C 和D 分别为对照、16Gy、20Gy和24Gy 辐射不定芽再生幼苗。） 3、基于ISSR 的辐射材料遗传变异分析 对供试的11 个样品进行ISSR-PCR，结果见表1。8条引物共扩增出71 条带，平均每条引物可扩增9 条带，其中多态性条带占70. 3% 部分引物扩增效果见图6 根据ISSR-PCR 结果，采用NTSYS-pc version2. 10e 软件计算出各样品间的遗传相似系数( 表2) 。 根据表2可以看出，辐射剂量为12Gy 时