第五章 海洋微藻的细胞操作.pptVIP

一、破碎细胞的方法 1.杆状玻璃匀浆器法 该匀浆器由一根端部表面磨砂的玻璃杆和一个内壁磨砂的玻璃套管组成。使用时，先用锋利的刀片把组织块切碎，然后把碎块加入套管中，用力使玻杆移动使组织细胞破碎。 2.高速组织捣碎机法 使用时将4℃预冷的组织碎块或细胞悬液加入捣碎机的梅花玻璃杯中，至杯体积的1/3即可盖好玻璃杯盖，固定好带杆叶片刀，缓慢调整旋转速度，一般开机数十秒后，组织细胞即可被高速旋转的叶片刀破碎。但不宜时间过长，以防高速旋转产生热而导致分离物中的活性物降解，用冷却水降温更好。 3.超声波处理法 超声波发生器能产生高强度的超声信号，经换能器传送至与之接触的溶液中，由声波形成冲击和振动而产生剪力，致使细胞破碎，动物组织肝、肾、胸腺、淋巴结、腹水细胞、红细胞、体外培养的细胞均可在短时间内破碎，因超声时可产热，应注意冰浴冷却，生物大分子如核酸和酶对超声敏感，一般不宜采用。 4.化学裂介法 在细胞悬液中加入Triton-100、NP-40、SDS，去氧胆酸钠均可使细胞裂解，往往仍需机械去辅助，方可在短时间内使细胞完全裂解，裂解后应清除化学裂解剂，以防止干扰分析。 5.反复冻融法 组织细胞浓液在-70℃或液氢中冷冻后，于37℃融化，经3～4次冻融周期，可使细胞破碎。 二、部分细胞器的分离方法 一般采用差速离心或密度梯度离心的方法得到分离细胞器。 差速离心 差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。 密度梯度离心 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。 1.细胞膜的分离 细胞膜又称质膜，分离细胞膜有助于研究生物膜的结构与功能。一般说，红细胞膜与线粒体膜的制备用差速离心法即可，其他细胞膜的分离可根据膜组分的密度大小不同，采用梯度离心后，分布于指定区域，可分离得到纯制品 线粒体普遍存在于真核细胞中，它是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需能量主要依靠在线粒体内进行氧化所产生的能，线粒体的分离主要靠差速分离。 3.线粒体膜分离 线粒体膜分离方法主要是密度梯度离心 4.聚核糖体的分离 核糖体是由核糖酸和蛋白质组成的核糖核酸蛋白颗粒，附着在粗面内质网的称固着核糖体，分散在细胞内的称游离核糖体，数个或数十个核蛋白体聚在一起称为聚核糖体，一般用差速离心法可分离出聚核糖体。 5.微粒体分离 微粒体是一种脂蛋白所包围的囊泡，含核糖核酸，蛋白质和脂类，分离微粒体的方法是利用分级离心法，去掉细胞核和线粒体后，经超速离心而制备。 三、细胞核的分离和细胞脱核技术 细胞核作为一个功能单位，完整地保存遗传物质，并指导RNA合成，进而表达出相应的蛋白，在一定程度上细胞核控制着细胞的代谢、生长、分化和繁殖活动。因此细胞核的分离是研究基因表达及细胞核形态结构的首要步骤。不同组织来源的细胞经匀浆后，可用分级离心等方法将细胞核进行分离纯化。 1、细胞核的分离 ?用溶液A粗提离心取沉淀B液中除蛋白，然后于C液中进行蔗糖密度梯度高速离心，沉淀用A液离心洗涤一次可收取。 ?(1)溶液A：0.25mol/L蔗糖 ?10mmol/L Tris-HCL pH8.0 ?3mmol/L MgCL2 ?0.1mmol/L苯甲基磺酰氟化物(PMSF为蛋白酶抑制剂，用乙醇现配) ?(2)溶液B：含0.1%(v/v)Triton×-100的溶液A。 ?(3)溶液C：2.2mol/L蔗糖 ?10mmol/L Tris-HCL pH8.0 ?3mmol/L MgCL2 ?0.1mmol/L PMSF 2、细胞脱核技术 细胞经松胞菌素B(Cytochalasin B；CB)以10mg/L浸没,以12000r/min离心15～20分钟，可使99%的细胞发生脱核，形成无核细胞质体(Cytoplast)和无胞质的核质体(Nucleoplast) * 5.4.1 培养类型 海洋微藻的培养类型按时间长短分为： 1 . 长期保存培养 2 . 短期保存培养 类型 长期保存培养 短期保存培养 定义 指长时间保持一特定的海藻以备将来的使用的培养，能在长达3个月甚至1年的时间里保持藻的活力 指藻体材料用于实验前的较短时间的培养 实验用法 一般不宜直接用于实验 可以直接用于实验 培养基 营养琼脂培养基：如蛋白胨的Bold营养琼脂培养基,用于绿藻