第二章基因操作技术原理.ppt

Agarose gel electrophoresis 二、 分类－琼脂糖凝胶电泳（RNA变性凝胶电泳） RNA由单链核苷酸组成，其局部可形成双链的二级结构或三级结构。因此欲测定RNA较准确的分子大小，必须在变性条件下进行电泳。其他同DNA电泳。 RNA变性条件下进行电泳，所使用的变性剂有甲醛、乙二醛、羟甲基汞、尿素和甲酰胺。尿素和甲酰胺通常用于RNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，因为它们会影响琼脂糖固化。在琼脂糖凝胶电泳时，用选择就是前三种。 用甲醛变性电泳后若需将核酸转移至硝酸纤维素膜上(如Narthern等)核酸需再经NaOH变性，控制不当易断裂RNA，甲醛还有强烈的刺激性气味。羟甲基汞是最理想的变性剂，但毒性大。因此，一般均选用乙二醛作变性剂。 1、乙二醛的处理 商品乙二醛为40%溶液(6M/L)。乙二醛中含少量的，乙二酸、乙醛酸和甲酸等氧化物。使用前必须经强碱强酸混合型树脂去离子，否则会把RNA降解。反复处理直至溶液pH值大于5.0为止。然后分装小份。 3、染色 染色最好能够用30μg/ml吖啶橙浸胶。尽量少用或不用溴化乙锭，因为乙二醛可与溴化乙锭发生化学反应，改变溴化乙锭的光谱性质。绝对应禁止将溴化乙锭灌注胶内。 1.5%琼脂糖分析小于1kb的RNA，1%琼脂糖分析大于1kb的RNA分子。电泳缓冲液应为10mM磷酸钠电泳液。 4、锚定PCR (anchored PCR) 扩增序列未知或其序列未全知的DNA序列锚定通常要获知一个引物方好些，这个引物必须是已知特异的。 锚定引物poly(dC)，其模板poly(dG)用末端转移酶加到单链DNA上去。 5、多重PCR (multiplex PCR) 基因太大，同时检测多个位点。因此分成几个区域来分别检测。如进行性肌营养不良症(DMD) 2000kb，视网膜母细胞瘤基因有数百个kb。还有如Genetyping，微卫星。 To be continued.….... 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍 30轮循环可获得—230个基因片段 Reaction Condition for a Typical PCR Assay Some DNA Polymerases Used in PCR Characteristics of Taq Polymerase 与待扩增的靶DNA区段两端序列（5’端）互补，的人工合成的寡核苷酸片断。 PCR引物 a.其长度通常在15～30个核苷酸之间。 419＝2.75X1011, 人类基因组长度3X109. b.3’端碱基必须与模板互补（5’ 3’延伸方向） c. G＋C含量50%～60%，嘌呤、嘧啶避免连续排列，一 对引物之间不能有2个以上的碱基互补，防止引物间产生引物二聚体，避免回文序列。 d.退火温度低于引物本身Tm值5℃。 PCR技术的特点: 1.特异性强 2.敏感性高 3.快速 4.简便 5.可扩增RNA和cDNA 6.对起始材料要求低 7.有一定程度单核苷酸碱基错误掺入 PCR扩增的长度：2kb 特异性 引物 引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。 生物样品 DNA片段 基因诊断 基因治疗 基因工程产品 法医学检测 人类学研究 …… 二、 PCR技术的应用 1、 反相PCR(reverse PCR) 与染色体步移(Chromosome walking) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 2－3kb 酶切 步骤： 用一种在靶序列上无切点的酶消化DNA 靶DNA区段2-3Kb 重新环化，按靶序列设计引物 经PCR，得到未知序列的DNA片段 可对未知序列扩增后进行分析，如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆，扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。 用来制备单链的DNA。 两种引物的浓度不同，低浓度的限制引物和高浓度引物，两者浓度相差约100倍。低浓度的引物浓度一般0.5～1.0pmol 2、不对称PCR (asymmertric PCR) 两种引物浓度 1：50-100 在mRNA反转录之后进行的PCR。将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。 3、RT－PCR