第三章基因文库的构建.pptVIP

⑤ 在 T7DNA polymerase 和 ligase 作用下，以带 U 的单链 DNA 为模板合成一条新链，形成杂合双链（新生链中无U碱基）。 ⑥ 感染 dut+ ung+ E.coli　MV1190 后，在细胞分裂过程中，只有新合成的 DNA 链才能起模板作用合成新的并引入了诱变位点的子代双链 DNA 。而有 U 的 DNA 链，在 dut+ 和 ung+ 产物的作用下，尿嘧啶被水解，从而失去作为模板的能力。（突变的新生DNA链与模板链分开） * 第四节 实例3:基因编码序列的丙氨酸扫描诱变 一、研究目的 对Foy蛋白60个氨基酸的小区域进行突变，获得功能信息 对基因中10个带点氨基酸位点进行突变 二、可供利用的资源（略） * * Pvu I PX 和AS1引物 Pvu I Xma III AS1 Xma III Xma III AS1 体外合成 Pvu I Pvu I AS1 + Pvu I处理 AS1 Xma III Xma III AS1 图解说明详见书P64 * * * * * * * * * 第三章 基因文库的构建 主要内容 第一节 DNA基因文库 第二节 亚克隆 第三节 克隆DNA序列的体外诱变 第四节 基因编码序列的丙氨酸扫描诱变 * DNA片段 的获得 载体构建 细菌转化 重组体 的鉴定 限制性内 切酶消化 机械切割 双链cDNA 的合成 化学法 直接合成 同聚物 加尾 粘性末端 连接 平末端 连接 加接头造成 粘性末端 重组噬菌体 DNA转染 重组质粒 的转化 体外包装 进行转导 表型鉴定 核酸杂交 免疫学分析 酶切鉴定 大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案 * Eco R1 Sal 1 Eco R1 Sal 1 Polylinker Bam H 1 Polylinker Bam H 1 AB Red+ gam+ Sal 1 Sal 1 λ EMBL3A AB Bam H1 Bam H1 Red+ gam+ Eco R1 Eco R1 Right arm polylinker oligonucleotide Left arm polylinker oligonucleotide Digest with Bam H1 and Eco R1 AB Bam H1 Bam H1 Eco R1 Right arm Left arm Isopropanol precipitation polylinker oligonucleotide not precipitated Target high molecular weight genomic DNA Sau 3A1 Sau 3A1 Sau 3A1 Sau 3A1 OH HO OH HO HO HO HO OH OH OH Sau 3A1 Sau 3A1 Sau 3A1 Sau 3A1 Sau 3A1 Sau 3A1 Size fractionation not neccessary Partial Sau3A1 digest Phosphatase AB Bam H1 Bam H1 Right arm Left arm Sal 1 Sal 1 Recombinant phage DNA concatemers + Packaging in vitro Plate on P2 lysogen sup+ Recombinant (Spi-) phage plaques 用λ载体EMBL3A构建基因组文库 * 第一节 DNA基因文库 用限制性内切酶酶切整个基因组DNA，把所得到的大量基因组DNA片段与载体连接，然后转化到细胞中去，让宿主菌长成克隆。是某个生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体。 cDNA文库：某个特定物种或器官的所有mRNA的组合。 建立DNA文库的目的：从复杂的基因组中分离基因。 * 二、 DNA文库的构建 （一）、基因组DNA库 1、 用λ克隆载体构建基因组文库 Question 1：构建含多少重组子的库能覆盖一个选定的基因组？ 考虑两个因素：载体的装载能力 目标基因组的大小 目标基因组的大小 载体装载的平均片段 ＝ 重组子的个数 * （一）、基因组DNA库 Question2：如何保证目标基因包含在所构建的文库中？ 考虑两个实际问题： 选择的载体装载量 所用的内切酶对基因组DNA的完全切割频率和不完全切割 二、 DNA文库的构建 * 人类基因组2.8X106Kb λ置换载体的平均置换片段20Kb 重组子的最小数目n＝1.4X105 考虑取样，酶切等原因，某些基因可能有多个重组子，而某些基因完全不包含。通过概率的统计，人类基因组中某个特