第二章分子克隆4.pptVIP

基因工程 Genetic Engineering 李黄金 Email: lihuangjin@ 生命科学与生物制药学院 ２００9 基因工程概论 四、DNA体外重组操作 3）DNA局部酶切消化 在基因文库构建中具有重要意义 DNA分子中只有部分限制位点被内切酶所切割而产生不完全消化的产物 可以通过缩短酶切消化反应的时间，降低反应的温度，减少酶用量来达到局部消化的目的. 一、用于基因转移的受体（宿主） 二、转化与扩增 一、用于基因转移的受体（宿主） 二、转化和扩增（转与增） 各种基因工程受体的特性 2）枯草芽孢杆菌 遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全 ，生长迅速，培养简单，不产内毒素 适用于重组蛋白与多肽、特别是微生物来源的酶的高效分泌表达，。 遗传欠稳定，载体受体系统欠完备 各种基因工程受体的特性 3）链霉菌 抗生素的主要生产者，相对操作简便，不产内毒素 主要用于抗生素生产菌株的改良 遗传不稳定，生长相对缓慢 各种基因工程受体的特性 4）酵母菌 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定 适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌 内源性蛋白产物种类繁多且含量高 各种基因工程受体的特性 5）昆虫细胞（家蚕，杆状病毒表达系统） 具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定 适用于真核生物基因的高效表达 DNA重组操作系统欠完善 各种基因工程受体的特性 6）哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO） 与人的亲缘关系近，表达系统完善，具有合适的糖基化修饰系统 适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体 细胞培养条件苛刻，生长缓慢 各种基因工程受体的特性 7）植物细胞（拟南芥菜、烟叶） 农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用 适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良 遗传操作繁琐 3、实验室常用的基因工程受体（宿主） 大肠杆菌 用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、 JM101（Aps、Tcs、Cms） 用于接受l-DNA：LE392、ED8654 真菌 哺乳动物细胞 CHO 毕赤酵母、汉森酵母、 啤酒酵母 酵母菌： 丝状真菌：黑曲霉、青霉 转化的原理与技术 转化率 转化细胞的扩增 几个基本概念 感受态（compentent )： 受体(宿主）细胞经过一些理化或生物学方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性的改变，成为能允许外源DNA进入的一种生理状态。感受态细胞（compentent cell ) 转化（transformation )： 质粒DNA导入受体细胞（宿主菌） ，并使之繁殖和表达的操作。 转化子（transformant)： 经转化而带有外源DNA的受体（宿主菌）细胞。 重组子（recombinant)： 含有重组DNA的转化子或重组DNA。相对于仅含空载体的转化子而言。 1、转化的原理与技术 Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化（Ca2+法） 细菌原生质体的转化（原生质体法） 完整细菌细胞的电穿孔转化（电转化法） l噬菌体DNA的转染 1）Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态即为感受态 。 大肠杆菌感受态细胞的制备： 100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体 用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心 用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体 冰浴放置12 - 24小时，备用 收集菌体 大肠杆菌感受态细胞的质粒转化： 取100 ml 感受态细胞，加入1-5ul相当于50 ng 载体的重组 冰浴放置半小时 在42℃保温 90秒（热脉冲） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟 DNA连接液，混匀。 加入1 ml 新鲜培养基，于37℃培养 1 小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行