禽流感病毒RT-PCR试验方法幻灯片.PDFVIP

禽流感病毒 RT-PCR 试验方法 禽流感病毒 RT-PCR 试验方法（一） 1 范围 本标准规定了禽流感病毒型特异性检测技术和禽流感病毒 H5 、H7 、H9 血凝素亚型及 N1 、N2 神经氨酸酶亚型的 RT-PCR 鉴别技术。 本标准适用于检测禽组织、分泌物、排泄物和鸡胚尿囊液中禽流感病毒核酸。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其 随后所有的修改单 （不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标 准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最 新版本适用于本标准。 GB/T 18936 高致病性禽流感诊断技术 3 实验室条件 3.1 仪器：PCR 仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、手提紫外线灯、紫外 凝胶成像仪、微量移液器、水浴箱等。 3.2 从事 RT-PCR 工作的实验室尽可能分区，根据条件划分出 RNA 提取区、基因扩增区、 电泳区。特别注意电泳后的琼脂糖凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。 3.3 注意个人防护和环境保护，电泳中用到的EB 可诱发基因突变，试验中被 EB 污染的物 品要有专用收集处，并通过焚烧作无害化处理。 4 试剂的准备 4.1 试剂 4.1.1 变性液：见附录 A.1 。 4.1.2 2M 醋酸钠溶液(pH4.0)：见附录A.2 。 4.1.3 水饱和酚（pH 4.0 ）。 4.1.4 氯仿/异戊醇混合液：见附录 A.3 。 4.1.5 M-MLV 反转录酶（200u/ μL ）。 4.1.6 RNA 酶抑制剂(40u/ μL) 。 4.1.7 Taq DNA 聚合酶(5u/ μL) 。 4.1.8 1.0% 琼脂糖凝胶：见附录 A.4 。 1 4.1.9 50 ×TAE 缓冲液：见附录 A.5 。 4.1.10 溴化乙锭(10 μg/ μL) ：见附录A.6 。 4.1.11 加样缓冲液：见附录 A.7 。 4.1.12 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水：见附录 A.8 。 4.1.13 5 ×反转录反应缓冲液（附录A.9 ）。 4.1.14 2.5mmol dNTPs （附录A.10 ）。 4.1.15 10 ×PCR Buffer （附录A.11）。 4.1.16 DNA 分子量标准。 4.2 引物：见附录 B 。 5 操作程序 5.1 样品的采集和处理：按照 GB/T 18936 中提供方法进行。 5.2 RNA 的提取 5.2.1 设立阳性、阴性样品对照。 5.2.2 异硫氰酸胍一步法 将组织或细胞中加入适量的变性液，匀浆。 将混合物移至一管中，按每毫升变性液中立即加入 0.1mL 乙酸钠，1mL 酚，0.2ml 氯仿-异戊醇。加入每种组分后，盖上管盖，倒置混匀。 将匀浆剧烈振荡 10sec。冰浴 15min 使核蛋白质复合体彻底裂解。 12 000 rpm ，4 ℃离心20min，将上层含RNA 的水相移入一新管中。为了降低被处 于水相和有机相分界处的 DNA 污染的可能性，不要吸取水相的最下层。 加入等体积的异丙醇，充分混匀液体，并在-20℃沉淀RNA 1h 或更长时间。 4 ℃ 12 000 rpm 离心 10 min ，弃上清，再用 75% 的乙醇洗涤沉淀，然后离心，再用 吸头彻底吸弃上清，在自然条件下干燥沉淀，溶于适量 DEPC 处理的水中。-20℃贮存，备 用。 5.2.3 或者选择市售商品化 RNA 提取试剂盒，完成 RNA 的提取。 5.3 反转录 5.3.1 取 5 μL RNA ，加 1 μL 反转录引物，70℃ 5min 。 5.3.2 冰浴 2min 。 5.3.3 继续加入： 5 ×反转录反应缓冲液 4 μL 0.1M DTT 2 μL 2.5mmol dNTPs 2 μL