湖工酶工程第三章研究.ppt

1. 萃取原理 利用酶或蛋白质等电解质与反胶团中表面活性剂分子亲水性头部所带荷电基团之间的静电作用以及反胶团的空间排阻作用来促使目标产物向反胶团中溶解。 2. 操作过程 微水相 反胶团 有机相 水相 （1）正萃取 （2）反萃取 3. 影响因素 （1）水相pH值。 （2）离子强度。 （3）表面活性剂和助表面活性剂。 （4）温度和相比。 （5）蛋白质的种类和浓度。 五、层析分离 又称色谱分离，利用溶液中不同的溶质组分与固定相之间相互作用的不同，使得不同的溶质组分随流动相通过固定相时的移动速度不同，从而使不同的溶质组分得以相互分离。 强疏水作用 反相层析 离子交换 离子交换层析 弱疏水作用 疏水层析 分配系数 分配层析 等电点 层析聚焦 吸附力 吸附层析 亲和力 亲和层析 分子量与形状 凝胶层析 分离依据 层析方法 分离依据 层析方法 表3-5 层析分离方法 梯度混合器 样品贮液器 层析柱 恒流泵 蛋白核酸检测仪 自动部分收集器 记录仪 　柱层析过程装置示意图 （一）凝胶层析 又称凝胶过滤层析、凝胶渗透层析、分子筛层析、分子排阻层析。以各种颗粒状的多孔凝胶作为固定相，利用溶质分子量的差异进行分离的层析分离法，称为凝胶层析。 凝胶颗粒 常用的凝胶介质：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯 酰胺凝胶等 特点：操作简单，样品回收率高，不需 要再生。分离速度慢，上样量有 限。 混合样品 小分子 中等分子 大分子 凝胶层析示意图 1. 层析原理 在凝胶层析柱中具有凝胶颗 粒内部微孔和凝胶颗粒间隙两种孔道结构。当样品溶液流过层析柱时，小分子溶质可通过扩散进入凝胶内部微孔中，移动速度慢，而大分子溶质只能在凝胶颗粒间隙移动，移动速度快，从而使得不同分子量的溶质相互分离。 2. 操作过程 （1）装柱 均匀，无气泡 （2）上样 适量，一般为床体积的10%，不超过30% （3）洗脱 恒定洗脱，流速要慢 （二）吸附层析 以各种固体吸附剂作为固定相，利用溶质分子与吸附剂之间吸附作用力的差异进行分离的层析分离法，称为吸附层析。 特点：吸附剂种类丰富，可再生，设备简单，成本低。但分辨率相对较低。 常用吸附剂：硅胶，硅藻土，活性炭，羟基磷灰石，氧化铝，磷酸钙，碳酸盐，陶土等。 常用洗脱剂：石油醚，环己烷，四氯化碳，三氯甲烷，甲苯，苯，二氯甲烷，乙醚、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、乙酸等。 1. 层析原理 溶质与固体吸附剂之间主要依靠范德华力产生吸附作用。 2. 洗脱方法 （1）溶剂洗脱法 洗脱展开法 （2）置换洗脱法 （3）前沿洗脱法 迎头分析法 （三）分配层析 利用样品中不同组分在两相间分配系数的不同来实现不同组分相互分离的层析分离法。 分配层析：纸层析、薄层层析 （四）离子交换层析 以各种离子交换剂作为固定相，利用荷电溶质与离子交换剂之间离子交换能力或静电作用力的不同使不同的荷电溶质相互分离的层析分离法。 1. 层析原理 不同的荷电溶质，所带电荷性和电荷量不同，与离子交换剂的离子交换力或静电吸附力不同，洗脱的难易程度不同，从而使不同的荷电溶质得以相互分离。 2. 离子交换剂的选择与处理 可交换离子 阴离子交换剂 阳离子交换剂 离子交换树脂 载体 离子交换纤维素 离子交换凝胶 阴离子交换剂 阳离子交换剂 氯型 羟型 钠型 氢型 R — NH4+ Cl- R — NH4+ OH- R — COO- Na + R — COO- H + 3. 离子交换层析的操作过程 （1）装柱 均匀，无气泡和裂缝 （2）上样 样品溶液应控制适宜的pH和较低的盐浓度 （3）洗脱 增加离子强度的梯度洗脱法 （4）再生 高浓度盐溶液洗脱或转型 （五）亲和层析 利用生物分子与偶联有亲和配基的固定相之间的特异而可逆的亲和作用力的不同使不同的生物分子相互分离的层析分离法。 生物亲和作用是指生物分子对之间所具有的特异而可逆的相互作用力。可将其中的任何一种生物分子与水不溶性载体结合，用来分离另外一种生物分子。与载体结合的生物分子称为配基（体）。 常用的亲和载体：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素等 1. 层析原理