FISH-荧光原位杂交实验（原位杂交）1.实验目的.PDFVIP

中国试剂网 3.18.16 FISH-荧光原位杂交实验（原位杂交） 1. 实验目的 通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。 掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。 2. 实验原理 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH ）是一门新兴的分子 细胞遗传学技术，是20 世纪80 年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发 展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因 组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗 传学和基因组进化研究等许多领域。FISH 的基本原理是用已知的标记单链核酸 为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合， 形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA 分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈 线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上 定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、 杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。 杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如a 卫星、卫星III 类的探针，其杂交靶位常大于 1Mb，不含散在重复序列，与靶位 结合紧密，杂交信号强，易于检测；2 ）全染色体或染色体区域特异性探针，其 由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到 噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3 ）特异性位置探针，由一个或几个 克隆序列组成。探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是 采用生物系标记的 dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕 联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧 光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信 号进行放大，从而可以检测500bp 的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针 核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷 酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度 不如间接标记的方法。 3. 实验用具及材料 中国试剂网 3.18.16 Y 染色体探针、人外周血中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染 色缸、载玻片、Nikon E-400 、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200mL 移液器、 20mL 移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温20 。 4. 实验方法及步骤 1）探针及标本的变性 （1）探针变性 将探针在75℃怛温水浴中温育5min，立即置0℃，5～10min，使双链DNA 探针变性。 （2 ）标本变性 ①将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3h 。（经Giemsa 染色的标 本需预先在固定液中退色后再烤片）。 ②取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70% 甲酰胺/2×SSC 的变性液中 变性2～3min 。 ③立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系 列脱水，每次5min，然后空气干燥。 2 ）杂交 将已变性或预退火的DNA 探针 10mL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖 上 18×18 盖玻片，用Parafilm 封片，置于源潮湿暗盒中37℃要交过夜（约15～ 。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本 17h） 的湿润状态，此过程在湿盒中进行。 3 ）洗脱 此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。 （1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。 （2 ）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50% 甲酰胺/2×SSC 中洗涤3 次，每次5min 。 （3 ）在已预热42～50℃的1×SSC 中洗涤3 次，每次5min 。 （4 ）在室温下，将玻片标本2×SSC 中轻洗一下。 4 ）杂交信号的放大