第八章蛋白质和氨基酸的测定[恢复].pptVIP

水杨酸比色法 原理：样品中的蛋白质经硫酸消化而转化成铵盐溶液后，在一定的酸度和温度条件下可与水杨酸和次氯酸钠作用生成兰色化合物，在660nm处比色测定，求出样品的含氮量，进而计算出蛋白质的含量。 （四）其他常用方法 福林-酚比色法； 考马斯亮蓝染料比色法； 红外光谱法； 比浊法； …… 我的是毛线 是棉线？ 是毛线？ 蛋白质灼烧时，会有烧焦羽毛的气味。 感知生活 你对蛋白质知多少？ 1、你知道怎么鉴别吗? 感知生活 你对蛋白质知多少？ 2、你知道如何鉴定豆腐富含蛋白质吗? 浓硝酸 呈黄色 第三节 氨基酸的定量测定 （一）甲醛滴定法 1、双指示剂甲醛滴定法 (1) 原理 氨基酸具有酸性的-COOH和碱性的-NH2。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，从而使其碱性消失，使-COOH显示出酸性，用碱标准溶液来滴定-COOH，并用间接的方法测定氨基酸的总量。 方法特点及应用 此法简单易行、快速方便。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏高；酪氨酸含有羟基，滴定时会消耗碱液使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果高。 特别适合浅色样品的测定 （2） 操作方法 移取含氨基酸约20~30mg的样品溶液2份。 中和游离酸（用中性红作指示剂，先测定其他游离酸的含量）：1份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点；记录消耗的碱液ml数，V1 。 滴定氨态氮（用百里酚酞作指示剂测定氨基酸和游离酸的总含量）：另1份加入3滴百里酚酞指示剂+中性甲醛20ml，摇匀，静置1分钟，用0.1ml/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点，记录消耗的碱液ml数，V2 。 （3）结果计算 X =(V2- V1)×c×0.014/m×100 X——样品中氨基态氮的含量，%（g/100ml） c ——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L； V1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准 溶液的体积，mL； V2——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标 准溶液的体积，mL； m——测定用样品溶液的质量（或体积），g(ml) 0.014——氮的毫摩尔质量，g/m mol 说明及注意事项 1、此法适用于测定食品中游离的氨基酸 2、固体样品应先进行粉碎，准确称取后用水萃 取， 50℃水浴中萃取0.5h即可。液体样品可直接进行测定。 3、若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。 4、与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和-COOH 时的pH为8.5~9.5，但分析结果稍偏低，即双指示剂法的结果更准确。 2、电位滴定法 (1) 原理 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。 -COOH被完全中和时，pH值约为8.5-9.5。 （2）操作方法 取样m→定容100ml→取20ml，加水60ml →用碱滴定至pH8.2→加入甲醛10.0ml →用碱滴定至pH9.2→记录碱消耗体积V1 空白试验：取水80ml →… →碱消耗体积V0 （3）结果计算 磁力搅拌器 酸度计的使用操作规程 调节开关 用缓冲溶液校正pH计 清洗电极 吸干电极上面的水 把电极插入被测溶液中 测定 清洗并擦干电极 （4）说明 甲醛的作用：固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性。 若样品中含有铵盐，测定结果偏高。 浑浊和色深样液不经处理可直接测定。 结果要求精密度≦10% ，即在重复条件下两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%。 （二）茚三酮比色法 原理：氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮生成蓝紫色化合物，其颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，在570nm处测吸光度进行定量。 操作方法 绘制标准曲线→样品测定→查出氨基酸质量 样品溶液需澄清，通常采用活性炭脱色处理。 （三）其他常用方法 邻苯二甲醛法 三硝基苯磺酸法 …… （四）氨基酸的分离和测定 1、薄层色谱法 2、氨基酸自动分析仪法 3、气相色谱法 4、HPLC 氨基酸自动分析仪分析 食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，缬，蛋，异亮，亮，酪，苯丙，组，赖和精氨酸等16种氨基酸，其最低检出