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免疫荧光实验步骤 V?? b3 e) h: r; _ * E9 M3 X?? r0 Z. S2 ^1. 直接免疫荧光法测抗原* _4 Q9 A+ c3 Q: w?? s: N（1）基本原理, R$ X4 }! `( ^1 J将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。8 J( W# I4 O E/ o2 P（2）试剂与仪器5 Y2 ?3 [$ T( a* g( ?? ?? 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 P7 W) S7 C; Y f8 |0 }! O- W ?? ?? 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释(8 R7 a; q7 p5 o1 ` ?? ?? 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2( 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制# t3 j8 g! p* W7 X) g$ F ?? ?? 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）(1 D) @ |) ~5 h0 G?? C ?? ?? 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）(3 {7 b% d# x6 N A+ A7 g. o/ w: O ?? ?? 荧光显微镜(# l: f X; m+ x! |% Q ?? ?? 玻片架( G8 o2 ~1 W+ M3 s) _?? B ?? ?? 滤纸(% J! b+ F1 F/ | v?? v( ?? ?? 37℃温箱等。* r9 U [, H) b* ]3 W4 q（3）实验步骤0 Y?? z+ {! O! R9 x2 Y2 X: D① 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。6 R, B6 X/ Y5 `5 e; P② 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。* `+ R6 J?? g. g③ 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。) s5 @ L% \ A$ M( [) @　　④ 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。) O9 A?? {# N. F }⑤ 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示： M9 d6 j- ~. S: ^1 n（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。6 q {% p/ r?? [ b* V（4）注意事项% C# U2 v$ M9 ~$ W W　　1)对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。/ }7 e% y3 M P3 n7 z; t2)染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。! e* `/ P; L [4 l5 U4 _　　3)为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。0 ]) D7 i: I% Y$ v% f) u5 W① 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。6 h3 e! V }- q. Z7 K, W② 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。$ b4 _2 x- q5 X# L/ W6 ]/ X. k d③ 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。/ |( J, g* F8 y; ^: W( V如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。. Q P! U+ y s: Y4 u　　4)一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。/ D, i/ x o8 Z) G0 N @5 P, {: T7 m?? n