法国梧桐叶与果.docVIP

材料与方法 1.1 材料与试剂 法国梧桐叶、法国梧桐落果 采集于新乡市洪门镇。 正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、正丁醇、无水乙醇、钨酸钠、磷钼酸 均为分析纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；磷酸分析纯（中国莱阳市双双化工有限公司）；AlCl3 (10%)；CH3COOK (1 M)；DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)为Sigma公司产品； DMSO (二甲基亚砜)；FeSO4?7H2O (10 mM)；EDTA（乙二胺四乙酸酸根离子,10 mM）；2-脱氧核糖（10 mM）；磷酸盐缓冲液（0.1 M，pH7.4）；H2O2（10 mM）；TCA（三氯乙酸2.8%）；TBA（二硫代巴比妥酸1%）；磷酸盐缓冲液（pH6.6）；K3Fe(CN)6 (铁氰化钾，1%)；TCA（三氯乙酸10%）；FeCl3(0.1%)；蒸馏水 实验室自制。 1.2仪器与设备 KQ-500B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；DHG-9070型电热古风恒温干燥箱 上海市三发科学仪器有限公司；BS124S电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-8型水浴锅 金坛市杰瑞尔电器有限公司；HH-S精密数显恒温水浴锅 常州市国立试验设备研究所；WB-2002水浴锅 郑州长城科工贸有限公司；UV-1100紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；Anke TGL-16B 型台式离心机 上海安亭科学仪器厂 ；SHB-III型循环水式多用真空泵 郑州国瑞仪器有限公司；低温冷却循环泵 郑州长城科工贸有限公司。 1.3实验方法 1.3.1 提取与萃取 将粉碎好的法国梧桐叶和果实分别乘装于10L广口瓶内，用90%乙醇和95%乙醇溶液浸泡于50 ℃恒温水浴锅中，加热回流提取24 h。对提取液用旋转蒸发仪进行浓缩蒸干，以上过程重复三次，得法国梧桐叶和果实提取物，再分别向法国梧桐叶和果实提取物中加入水，以正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇的顺序按1:1的比例进行萃取；每种溶剂萃取三次，最后得到水层。去除溶剂得到的法国梧桐叶和果实提取物和各层萃取物组分。 1.3.2 DPPH自由基清除能力的测定 原理：DPPH自由基是一种比较稳定的自由基，在517 nm处有最大吸光度,其醇溶液呈紫色。当它遇到自由基清除剂时，与自由基清除剂配对，化合物溶液从紫色变为淡黄色。此时，DPPH基团在517 nm处的吸光度减小，由于褪色程度与电子数量成定量关系，因此可以通过测定加入样品时的517 nm下的吸光度变化，从而求得该样品对自由基的消除率[1]。 样品对DPPH自由基的清除能力依据Yen和Chen（1995）[2,3]的方法修改后来测定样品清除DPPH自由基的能力。即Ao: 0.5 mL 0.2 mmol/L的DPPH甲醇溶液+0.5 mL试样溶剂，Ai：0.5 mL 0.2 mmol/L的DPPH甲醇溶液+0.5 mL待测样品溶液，Aj: 0.5 mL样品溶液+ 0.5 mL试样溶剂,混合均匀后室温下于暗处静置30 min，然后在517 nm处测定吸光度。由下面的方程式（1）计算样品对DPPH自由基的清除能力： 消除效率（%）=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100％ （1） 其中：A0为对照组的吸光度 Ai为测试组的吸光度 Aj为空白组的吸光度 方法：将正己烷层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层和95%乙醇层待测样品分别配制成25、50 、100 μg/mL的一系列溶液，然后配制Ao、Ai、Aj，最后测定对应待测样品浓度的吸光度，每个样品的每个浓度重复3次。计算DPPH自由基清除率和不同层样品对DPPH自由基清除能力的EC50值，并绘制DPPH自由基清除率对样品浓度柱状图。 1.3.3 羟基自由基消除能力的测定 原理：Fe3+的螯合物(如Fe-EDTA)存在下的Fenton型Haber-Weiss反应可产生·OH，反应方程式为：Fe2+ + H2O2 →Fe3+ + OH- +·OH工艺上将Fe2+和H2O2的组合成为Fenton试剂[4]。反应生成的羟基自由基能够进攻2-脱氧核糖，使其降解生成丙二醛。氧化产物丙二醛能够与硫代巴比妥酸进行显色反应，生成粉红色物质在532 nm处有最大光吸收。如果在溶液体系中加入具有清除·OH功能的被测物质，它可以与2-脱氧核糖竞争羟基，使产生的红色物质减少，即532 nm处的吸光度减小。因此可以通过测吸光度间接测其对羟基自由基的清除作用[5]。 由下面的方程式（2）计算样品对羟基自由基的清除作用： 消除效率（%）=（1-As/Ao）× 100％ （2） 其中：As为待测溶液的吸光度 Ao为对照组溶液的吸光度 方法：将正己烷层、二