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生物技术实践 一、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1．选择合适的培养基 (1)根据培养基的用途可分为选择培养基和鉴别培养基 2．统计菌落数目的方法 (1)显微镜直接计数法 ①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。 ②方法：用计数板计数。 ③缺点：不能区分死菌与活菌。 (2)间接计数法(活菌计数法) ①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长着一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 统计菌落数目 常用稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目。样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为保证结果准确，一般选择菌落数30—300的平板计数。 ②操作 a．设置重复组，增强实验的说服力与准确性。 b．为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。 ③计算公式：每克样品中的菌株数＝C/V×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。 3．细菌分离与计数的实验流程 土壤取样→样品稀释→取样涂布→微生物培养→观察并记录结果→细菌计数。 二、分解纤维素的微生物的分离 1．纤维素酶 是一种复合酶，它包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。 2．纤维素分解菌的筛选原理 (1)刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。 (2)纤维素分解菌能增生纤维素酶分解纤维素，从而使菌落周围形成透明圈。 3．土壤中纤维素分解菌的筛选 (1)方案 土壤取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。 (2)选择培养的目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离到所需要的微生物。 (3)涉及的微生物技术主要有：培养基的制作、无菌操作、稀释涂布平板法、选择培养基的作用、土壤取样等。 * * 掌握程度参考本考试大纲中的： 一、考试的能力要求 2、实验与探究能力 （1）从生物材料中提取某些特定的成分 （2）运用发酵加工食品的基本方法 （3）植物的组织培养 ? 5-2? 生物技术在食品加工及其他方面的应用 掌握程度参考本考试大纲中的： 一、考试的能力要求 2、实验与探究能力 （1）微生物的分离和培养 （2）培养基对微生物的选择利用 （3）利用微生物发酵来生产特定的产物 ? 5-1? 微生物的利用 要求 实验 （2）按培养基的物理形态分： 液体培养基 半固体培养基 固体培养基 一 培养基: （3）按培养基的功能分： 基础培养基 选择培养基 鉴别培养基 （1）按培养基的化学成分分： ·天然培养基 ·合成培养基 ·半合成培养基 选择培养基 加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞 加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基: 分离杂交瘤细胞 各种培养基的具体配方不同，但一般都包括哪些成分？ 不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、 无机盐等营养物质。 注： 另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。 (1)无菌技术具体操作 ①对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。 ②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 ③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 ④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 二 无菌技术：无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。 1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min 3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源 4、紫外线消毒 …… (2)常用消毒的方法： 1、灼烧灭菌: 2、干热灭菌：160-170 ℃下加热1-2h。 3、高压蒸气灭菌：100kPa、121 ℃下维持15-30min. (3)常用灭菌的方法： 灼烧灭菌、干