第2章 鸡(Gallus gallus) IFNγ基因重组蛋白.docVIP

鸡(Gallus gallus) IFNγ基因重组蛋白 复性条件的优化及生物活性鉴定 摘要：本文用18种不同的复性缓冲液对表达纯化的cIFNγ进行复性处理，通过SDS和对鸡胚成纤维细胞和鸡胚的保护实验检测复性产物的得率和生物学活性。研究结果表明：去污剂和疏水剂能保证蛋白的复性得率和复性效率，重组表达产物得率可高达94.7%；氧化还原电势对是cIFNγ成功复性的关键，有生物学活性的复性产物的复性液中均含有氧化还原对GSSG/GSH；经去污剂处理后再复性的产物对保护细胞的有效浓度显著低于直接复性的蛋白。 关键词：鸡重组干扰素γ；复性条件；生物学活性 IFNγ属于Ⅱ型干扰素，又称免疫干扰素，是在特定诱生剂的作用下由多种细胞产生的具有高度生物活性的可溶性糖蛋白，是一种重要的细胞因子γ在抵抗哺乳类和鸟类病原侵染中具有重要的作用，肿瘤、细菌、病毒以及寄生虫等多重作用IFNγ对流感病毒、新城疫病毒[6]，马立克氏病毒[7-9]，鸡劳氏肉瘤病毒[10]等具有较好的抑制作用，它不仅参与机体对病原侵害的保护性应答，还通过细胞的信号通路广泛参与包括调节机体MHC II成熟抗原呈递等免疫调节，是机体重要的免疫增强剂。鸡的IFNγ基因由4个外显子和3个内含子组成本实验室从依莎褐鸡中克隆获得的cIFNγ (Genbank accession number：AY705909 )IFNγ[12] 。但由于鸡IFNγ在大肠杆菌中高效表达，其表达产物主要以无活性的包涵体形式存在，须对包涵体进行变性、复性等后续处理工作，以获得具有生物学效应的重组表达产物。不同的重组蛋白的复性条件有非常大的差异，复性效率显著不同，这些严重制约鸡IFNγ的工业化生产。因此，我们对蛋白质复性条件进行优化，力求找到一种简单、价格低廉、复性得率和效率较高的方法，为鸡IFNγ的工业化生产奠定基础。 1 材料与方法 γ（cIFNγ）蛋白表达产物 纯化的鸡重组γ由课题组制备1.2 SPF鸡胚 SPF鸡胚(北京梅利亚维通实验动物技术有限公司)， 38℃，控制湿度≈60%1.3 鸡新城疫病毒Rubulavirus Newcastle disease virus (NDV) 新城疫病毒NDV（），购自国家兽医微生物菌种保藏中心，经鸡胚尿囊，增殖一代，毒力为10-CLD50 /0.10ml。 γ复性条件的探索 1.4.1 利用缓冲液置换，以PBS进行透析复性 将纯化得到的鸡重组干扰素γ的浓度稀释到100μg/ml[13]，将其全部转移入透析袋后，放在4℃预冷的透析液Ⅰ-Ⅲ（40mM Tris-Cl，300mM NaCl, Urea浓度分别为6.0M、4.5M和3.5M，调pH=8.0）中透析24h，每种透析液持续透析8h，每4h更换一次。转移5ml至一新透析袋，放入透析液Ⅳ（PBS）中透析24h，间隔4h更换一次透析液，期间用磁力搅拌器温和搅拌。复性完毕，取1ml样品，4℃,10000g离心取上清液进行考马斯亮蓝蛋白质定量和SDS电泳分析。 1.4.2 利用不同复性液进行透析复性 参照1.4.1的方法，将纯化得到的鸡重组干扰素γ中的变性剂浓度透析降低至3.5M后，分别转移至新透析袋放入透析液Ⅳ（相应的复性缓冲液）中透析复性24h。复性完毕，转移至PBS中，透析除去残留的变性剂。取最终复性完成的样本1ml，4℃,10000g离心取上清液进行考马斯亮蓝蛋白质定量和SDS电泳分析。 1.4.3去污剂作用效果分析 将纯化得到的鸡重组干扰素γ的浓度稀释到100μg/ml，分别将TritonX-100加入到透析液Ⅰ-Ⅲ处理前后的变性蛋白质溶液中，4℃磁力搅拌器温和搅动4h，再参照1.4.2的方法在复性试液16中进行复性及分析。 1.4.4 疏水剂作用效果分析 参照1.4.3，将经透析液Ⅰ-Ⅲ处理后加入TritonX-100的鸡重组干扰素γ所得的样品平均分成五份，向第一、二份样品中加入β-CD，温和搅动2h，将第一、三份样品分别放在不添加PEG的复性试液16中进行复性处理，将第二、四份样品分别放在不添加任何疏水剂的复性试液16中进行复性及分析，第五份样本放在复性试液16中进行复性。 1.5鸡重组干扰素γ复性产物的抗病毒活性分析 1.5.1 细胞实验分析cIFNγ复性产物的抗病毒活性 本次实验测定新城疫病毒（NDV）对鸡胚成纤维细胞的毒力（TCID50）为10-6.123/0.1ml 。取9日龄鸡胚制备鸡胚成纤维细胞[12]，待接种于96孔板的细胞生长致密后，选用在复性试液3、8、11和16中复性完成的蛋白，分别在培养的细胞中加入5、10、20、0、0 、160、320ng·ml-1) 的cIFNγ处理h，然后以浓度，每孔20ul的NDV感染细胞。同时设置空白对照组（无cIFNγ和病毒）、阳性对照组（