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松材线虫实时荧光PCR检测技术的研究 摘要 松材线虫病是一种重要的林业病害，向来有“松树的癌症”的称号，对 松树的危害十分严重，它的病原是松材线(Bursaphelenchusxylophilus)。 它是包括日、韩、美、加拿大、墨西哥、尼日利亚和我国等许多国家重 要的林业病害，也是许多国家的检疫对象，在我国属于二级检疫危害生物， 造成的损失难于估计。但是因为它和致病性弱的拟松材线虫在形态上极 其相似，从形态上难以区分，尤其是低龄期幼虫，这对松材线虫检疫和防 治带来了很大的困难，所以松材线虫的快速检测至关重要。传统的形态 鉴定、生化以及其他分子技术等方法存在费时、准确度不高、灵敏度低 等缺点、不易形成标准。因此建立标准、快速、准确、灵敏的方法具有 重要的意叉。 实时荧光PCR技术、生物芯片技术等已经应用于松材线虫格测方法的研 究，这些方法能够准确、有效地鉴别和鉴定松材线虫，但是，仍然需要 较长的时间，仍然不能够满足口岸检疫的要求。实时荧光定量PCR能够 在DNA扩增过程中获得结果，缩短了检测时间，本研究旨在建立松材线 虫的实时荧光PCR检测技术。 本文首先进行了不同线虫的基因组DNA提取方法的筛选，确定了一 种适宜荧光PCR方法的提取方法，即蛋白酶K方法进行单条线虫基因组 DNA抽提，此方法既经济又快速，减少了一些操作上的人为污染，可以 用于快速地进行普通PCR检测以及实时荧光PCR检测。 其次，通过对松材线虫和拟松材线虫核糖体DNAITS区的克隆，并 进行测序，运用ClustulXl．8．1软件进行比较，松材线虫同一种群的序列 片段长度为872bp，同源性达到100％，拟松材线虫同一种群的序列片段 为867bp，其中有23bp差异，同源性迭97．3％，松材线虫和拟松材线虫 不同种之间867bp中，有119bp的差异，同源性迭86．2％。根据差异最大 的区域设计了TaqMan荧光探针，确定了检测条件和参数，建立了实时荧 光PCR方法，该方法指在PCR反应体系中加入带有荧光基团互补的探针， 如果有PCR反应进行，荧光信号就扩大，这样利用荧光信号的积累可以 实时监测整个PCR进程，实现了PCR扩增和核酸杂交以及荧光信号放大 检测同步进行的自动化检测技术；实时荧光PCR技术其他的优点是：这种 技术在同一PCR试管内完成PCR扩增、荧光探针杂交并口信号检测，大大 降低了污染的可能性，提高检测特异性，使得这一PCR技术准确性达到 了要求最严格的法检要求；荧光探针检测比常规的凝胶染色检测灵敏度 提高上百倍，在有些检测领域已接近检测灵敏度的极限，成为最灵敏的 检测方法；检测时间缩短到30rain～2h完成；一次最多能同时检验384 个样品。真正做到快速、准确、灵敏和高通量。 在上述研究的基础上，优化了实时荧光PCR体系的条件，引物浓 度在400rtM／400riM(上游引物／下游引物)时为最佳引物浓度，此时探 针浓度为200 nM；最佳的镁离子浓度为3mM，最佳的酶浓度为3U／50ul， 最佳延伸温度为60℃，其他的组分对整个程序的影响不大只要足量即可； 同时通过单条线虫检测测定了探针敏感性，通过测试的11个不同种群的 线虫，证明探针的特异性，能有效的区分和鉴定松材线虫，建立一种快 速、高效的检测松材线虫方法。 关键词：检测松材线虫核糖体DNAITS区实时荧光PCR 一2一 刖 舌 l松材线虫病概述 1．1松材线虫的危害以及分布 松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)是为害松树特别是赤松和黑松 的毁灭性线虫病原，主要由墨天牛属松褐天牛和其他几种天牛传播，危害蔓 延迅速，几十米高的松树一旦染病，30多天即会因线虫的大肆繁殖，危害， 阻塞松脂道、充塞木材髓部，致针叶先萎蔫下垂后黄枯如火烧，最终全树死 亡，而线虫存活其中，集聚滞休于天牛幼虫蛹室周围，并随木材运输分散传 播，待天牛羽化时从天牛体孔(气门)钻入，天牛分飞携带再次迁传，由天 牛取食松嫩枝的伤口进入新树进行再危害。它是植物线虫中能如此迅速传播、 迅速危害致死寄主的罕有线虫种，也是现知罕有的以另一种动物为宿主迁移 传带的植物线虫。 此线虫病现已被世界各国列为对外检疫对象，可危害30多种松树，此外 落叶松、白云杉、水杉、黄杉、冷杉或雪松也可感病。在日本主要危害赤松、 黑松、琉球松、日本五针松。另外在德国鱼鳞松、雪松