595 nm - 大连理工大学精品课程.PDF

大连理工大学 环境与生命学院 实验二 蛋白质的比色定量分析 —— 考马斯亮蓝法 指导教师：金礼吉 副教授 李 宁 工程师 生物科学与工程系生物化学实验教学研究室 大连理工大学 环境与生命学院 实验目的： 熟悉分光光度计的基本原理和使用方法 掌握利用考马斯亮蓝定量分析蛋白质的方法 生物科学与工程系生物化学实验教学研究室 大连理工大学 环境与生命学院 实验原理： 实验原理： 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中的游离状态呈红褐色，与 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中的游离状态呈红褐色，与 蛋白质通过范德华力结合呈蓝色，且最大吸收波长从 465 nm 蛋白质通过范德华力结合呈蓝色，且最大吸收波长从 465 nm 转变为 595 nm 。在一定蛋白浓度范围内符合比尔定律， 转变为 595 nm 。在一定蛋白浓度范围内符合比尔定律， 595nm的光密度与蛋白浓度成正比，因此可通过测定 595 nm 595nm的光密度与蛋白浓度成正比，因此可通过测定 595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 生物科学与工程系生物化学实验教学研究室 大连理工大学 环境与生命学院 实验器材： 试管及试管架，移液管（0.1ml 及5ml ） 试管及试管架，移液管（0.1ml 及5ml ） 756分光光度计 756分光光度计 762分光光度计 762分光光度计 生物科学与工程系生物化学实验教学研究室 大连理工大学 环境与生命学院 配置试剂： 1、生理盐水：称0.9g NaCl 溶于100ml蒸馏水中。 1、生理盐水：称0.9g NaCl 溶于100ml蒸馏水中。 2 、蛋白质标准液（250μg/ml ）：可用结晶牛血清清蛋白或酪蛋 2 、蛋白质标准液（250μg/ml ）：可用结晶牛血清清蛋白或酪蛋 白，用生理盐水溶解并定溶稀释。 白，用生理盐水溶解并定溶稀释。 3 、蛋白质标准液（500μg/ml ）：小牛血清白蛋白50mg加生理盐 3 、蛋白质标准液（500μg/ml ）：小牛血清白蛋白50mg加生理盐 水至100ml。 水至100ml。 4 、考马斯亮蓝G-250溶液：称100mg考马斯亮蓝G-250 ，加95% 4 、考马斯亮蓝G-250溶液：称100mg考马斯亮蓝G-250 ，加95% 乙醇50ml ，加85% （W/V ）H PO 100ml ，用蒸馏水定溶至 乙醇50ml ，加85% （W/V ）H PO 100ml ，用蒸馏水定溶至 3 4 3 4 1000ml，置棕色瓶过夜，再用二层滤纸过滤。最终试剂中含 1000ml，置棕色瓶过夜，再用二层滤纸过滤。最终试剂中含 0.0