rEK合成项目.docVIP

下载本文档

2
0
约小于1千字
约 2页
2017-06-27 发布于江西
举报
版权申诉

rEK合成项目.doc

1、原创力文档（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。。
2、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击这里二次下载。
3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
4、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
5、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
6、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
7、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次，网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档

rEK合成项目

rEK合成的开发目的肠激酶(Enterokinase，EK)是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶。分子质量为150KD,由1条115KD重链和1条35KD轻链组成,在pH值4.5～9.5、温度4～45℃范围内特异性水解蛋白底物。由于经EK裂解融蛋白所释放的目的多肽具有和野生型完全一致的N末端氨基酸序列,因而可作为蛋白表达体系中融合蛋白的切割试剂，使其在融合蛋白的下游纯化中有着巨大的应用价值。目前市售的EK价格非常昂贵（例如：Sigma公司重组rEK，1200多元只能切割20mg融合蛋白），天然提取的EK易为其它蛋白酶污染,造成切割融合蛋白的同时又降解了目的产物。因而我们采用基因工程的方法以弥补这些不足，并显著降低蛋白药物的开发和生产成本。主要pET32a(+)，已保存。菌种：大肠杆菌DH5(、BL21(DE3)，已保存。引物：由上海生工合成。包含牛肠激酶轻链(rEK)全长基因708bp，共235个氨基酸。 F1: 5-′GGA GGTACC（Kpn1）GACGACGACGACAAG（rEK识别位点) ATT GTC GGA GGA AGT-3’ F2: 5-′GGA GGTACC（Kpn1）ATT GTC GGA GGA AGT-3 R: 5′- GCG GAATTC (EcoR1) TTA ATG TAG AAA ACT TTG -3’ rEK基因来源：健康北方黄牛割颈动脉处死，取十二指肠组织，抽提RNA逆转录。主要实验步骤 1. pET32a-rEK原核表达载体构建 2. 重组质粒的鉴定. 重组融合蛋白的诱导表达. 重组融合蛋白的纯化重组融合蛋白的SDS鉴定 7. rEK大量制备生产项目开发预算名称公司（货号）价格引物上海生工 2元/bp *90bp=180元 DEPC水 TaKaRa (D602A) 50元 pfu高保真聚合酶 TaKaRa (DRR02AM) 300元 dNTP TaKaRa (D4030RA) 80元 DNA marker 2000 TaKaRa (D501A) 180元测序上海联众约300元总计：1090元 2010-11-20