高效液相简介及常见问题分析.pptVIP

高效液相色谱简介 常见色谱故障： 压力过低： 溶剂进口过滤芯被堵 连接管路泄漏或其他备件泄漏 溶剂或流速的改变 主动阀失灵 四元比例阀失灵 单向出口阀失灵 柱子失效（固定相流失） 高效液相色谱简介 简介： 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用 高效液相色谱简介 特点： 高效液相色谱法有“四高一广”的特点： 1. 高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压 2. 高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时 3. 高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍 4. 高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级 5. 应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势 6. 柱子可反复使用：用一根柱子可分离不同化合物 7. 样品量少、容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备 高效液相色谱简介 此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱 高效液相色谱简介 HPLC仪器的配置及流程： 高效液相色谱简介 色谱分离的机理： 高效液相色谱简介 色谱的图形结果： 高效液相色谱简介 色谱柱 进样阀 脱气装置 流 动 相 检测器 高压泵 构造： 高效液相色谱简介 高效液相色谱构造： 输液泵：多用柱塞往复泵，柱塞向前运动，液体输出，流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸入缸体。如此往复运动，将流动相 源源不断地输送到色谱柱中 高效液相色谱简介 高效液相色谱构造： 色谱柱：常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等 高效液相色谱简介 高效液相色谱构造： 色谱柱：在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图 化学键合固定相应用，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t(R)和半高峰宽W(h/2)，按n=5.54[t(R)╱W(h/2)]^2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求 高效液相色谱简介 高效液相色谱构造： 检测器：分为紫外检测器和荧光检测器。 紫外检测器：是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测器，其工作原理是Lambert-Beer定律，即当一束单色光透过流动池时，若流动相不吸收光，则吸收度A与吸光组分的浓度C和流动池的光径长度L成正比 高效液相色谱简介 高效液相色谱构造： 荧光检测器：是高压液相色谱仪常用的一种检测器。用紫外线照射色谱馏分，当试样组分具有荧光性能时，即可检出 高效液相色谱简介 高效液相色谱构造： 流动相： 1. 溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性 2. 溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长 3. 高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50～IOOnm 4. 化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂 5. 低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇