生物化学综合实验二.DOC

生物化学综合实验二 动物组织中RNA与DNA的制备与测定 一、目的要求： 1、学习用苯酚法及盐溶液法从动物组织提取核酸的原理及操作技术； 2、学习掌握测定核酸含量的定糖法（地衣酚法和二苯胺法）的原理和操作技术； 二、实验原理 （一）核酸制备原理 核酸与蛋白质是构成生物有机体的主要成分，在生物体中它们结合成核蛋白体的形式存在。核酸按其化学组成可以分为两大类：脱氧核糖核酸与核糖核酸。前者存在于细胞核，后者存在于细胞质与核仁。由于核酸极不稳定，在较激烈的化学、物理和酶的作用下很容易发生降解。因而制备核酸要防止过酸、过碱及其它能引起核酸降解的因素的作用。在提取过程中为了防止组织中广泛存在的核糖核酸酶对核酸的降解作用，全部过程应在低温（0℃左右）操作。必要时还要加入抑制剂，以抑制酶的作用，如柠檬酸、氟化物、EDTA（乙二胺四乙酸）等。如果采用SDS－Na2或苯酚作为蛋白质变性剂来分离核酸，它们同时也可以使核酸酶（RNA酶与DNA酶）破坏，因而常获得较好的分离效果。本实验以动物肝脏为原料采用苯酚法提取RNA、浓盐法提取DNA。 利用苯酚法可以直接从组织中提取RNA，组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶解于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则存在于酚层中。向水相加入乙醇后，RNA即呈白色絮状沉淀析出。 动植物的DNA核蛋白能溶于水及其高浓度的盐溶液，但在0.14mol/L盐溶液中溶解度很低；而RNA核蛋白则溶于0.14mol/L的盐溶液中。利用核蛋白的这种性质，即可把RNA核蛋白与DNA核蛋白分开，当核蛋白与氯仿一起振荡时，蛋白质变性，形成凝胶，并与核酸分离，核酸存在于水相中。向含有核酸的水相中加入乙醇，核酸即呈纤维状沉淀析出。也可以用苯酚法提取DNA，先用特定pH的苯酚溶液处理，然后离心分层，DNA或存在于上层水相，或存在于中间残留物中。蛋白质变性后停留在酚层中。由于苯酚能使蛋白质迅速变性，因而抑制了核糖核酸酶的活性，并且，操作过程较缓和，可以得到较好的DNA制品。所以近年来一般都用苯酚法提取DNA。 （二）DNA与RNA的含量测定原理： 1、二苯胺显色法测定DNA含量的原理 DNA 在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω－羟基－γ－酮基戊糖，后者与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在595nm 波长处有最大吸收。DNA 在40～400μg/mL 范围内，光吸收与DNA 的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。 2、地衣酚显色法测定RNA含量的原理 当核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转化成糠醛，后者在三氯化铁存在下与3,5－二羟基甲苯（地衣酚）反应，生成绿色物质，其最大光吸收值在670nm 处。通常RNA溶液在20～250μg/mL时，光吸收与RNA 的浓度成正比。需要说明的是：地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均可与地衣酚反应，DNA 及其他杂质也能给出类似的颜色。因此测定RNA 时，要考虑DNA 等杂质影响，可先测定DNA 含量，再计算出RNA 含量。 三、试剂及器材 （一）制备RNA和DNA试剂 1、90%的苯酚溶液（W/V）：苯酚应为白色固体，否则应重蒸一次。或直接采用重蒸苯酚。（作用：蛋白质变性剂） 2、醋酸钾粉末（此物易潮解，称量应迅速）（作用：溶解RNA，并保持一定离子强度） 3、0.1 mol/L氯化钠－0.05mol/柠檬酸钠溶液(pH6.8) （作用：溶解RNA并抑制DNA酶） 4、1.0 mol/L氯化钠(pH6.8) （作用：溶解DNA） 5、氯仿－异戊醇混合液20∶1（V/V）（作用：蛋白质变性剂） 6、75%乙醇（作用：溶解醇溶性物质如寡糖及极性脂质） 7、95％乙醇（作用：核酸DNA或RNA沉淀剂）　 （二）测定DNA和RNA试剂 1、DNA 标准溶液 准确称取小牛胸腺的DNA 钠盐，以0.01mol/L NaOH 溶液配成200 μg/mL的溶液。 2、二苯胺试剂 称取1g 纯二苯胺， 溶于100mL 的分析纯的冰乙酸中，再加入60%以上的过氯酸10mL（AR），混匀待用。临用前加入1mL 的1.6%乙醛溶液，配好的试剂应为无色（该试剂一周内有效）。 3、RNA 标准溶液：取酵母RNA配成100 μg/mL 的溶液。 4、地衣酚试剂 先称取100 mg三氯化铁溶于100 mL 浓盐酸中（配制0.1%浓度的溶剂）备用。在使用 前加入100mg 地衣酚配制成0.1%浓度的地衣酚试剂。 （三）主要器械：分光光度计 四、操作步骤： （一）RNA的制备 将大白兔先饥饿1～2天，使肝糖原降低，用断头法杀死，立即取出肝脏，放在置于冰浴的小培养皿中，迅速除去结缔组织，称取3克肝组织，剪成小块，置于研钵中加3