7.生物素-亲和素免疫放大技术.pptVIP

第十一章 生物素－亲和素免疫放大技术 王 辉 新乡医学院医学检验系 概述： 70年代后期在免疫酶技术中利用生物素-亲和素系统(Biotin-Avidin System BAS)标记抗体发展了又一种新型生物反应放大技术。 早在1916年Bateman第一個發現雞蛋蛋白中有一種有毒物質，直到1927年Boas才發現某種食物可以預防蛋白的毒性。之後的研究，即將此種可抗蛋白毒性的物質---生物素分離出來。生物素的結構於1936年被發明而出，也在1943年即能在實驗室中合成此種物質。 第一节 生物素－亲和素系统的特点 生物素（Biotin)有两个环状结构，I环为与亲和素结合的主要部位；II环为结合抗体和其它生物大分子的部位。 BAS可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，也可制成亲和介质用于上述各类物质的纯化。 BAS的特点：灵敏度高、特异性强、稳定性好、适用于多种反应体系。 第二节 生物素的理化性质与标记 一、生物素及其活化 生物素经活化后 , 可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物。 几种常用于标记不同类型生物大分子的活化生物素的制备及特性。 标记蛋白质氨基的活化生物素 生物素的分子量较小，当与抗体或酶反应形成生物素标记结合物后，由于大分子蛋白的空间位阻效应(steric hindrance),可对生物素与亲和素间的结合以及BAS的应用效果造成干扰。 长臂活化生物素 (BCNHS) 是在生物素和 N- 羟基丁二酰亚胺之间添加了两个 6- 氨基己糖分子基团，形成连结臂， 使其与抗体、酶等生物大分子结合后，不受位阻效应的影响, 更易发挥生物素的活性作用。 ( 二 ) 标记蛋白质醛基的活化生物素 用于此类标记的活化生物素有两种 : 生物素酰肼 (biotin hydrazine,BHZ)主要用于偏酸性糖蛋白的生物素标记 肼化生物胞素 (biocytin hydrazine,BCHZ) 除可与蛋白质的醛基结合外，它还与 N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）相同，能与蛋白质的氨基结合，因此其适用范围较BHZ宽。 （三） 标记蛋白质巯基的活化生物素 3 － (N －马来酰亚胺－丙酰 )- 生物胞素 [3-(N-maleimido-propiny)-biocytin,MPB] 是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂 （四）标记核酸的活化生物素 活化生物素可通过缺口移位法、化学偶联法、光化学法及末端标记法等技术使生物素的戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连, 构成生物素标记的核酸探针。 光生物素(photobiotin) 它是一种化学合成的生物素衍生物 生物素脱氧核苷三磷酸 先将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素 BNHS和BHZ二者均可以在一定条件下与核酸胞嘧啶分子中的 N4 氨基交联, 使核酸分子生物素化。 二、生物素标记蛋白质 （一）生物素化蛋白质衍生物的特性 一个蛋白质分子可联结多个生物素分子, 从而使其具较高的比活性, 在与亲和素的反应中成为多价。生物素化大分子的多价性 , 是 BAS 多级放大作用的物质基础。 生物素化蛋白质衍生物有二类 , 一种是生物素化的大分子生物活性物质 ( 如抗原、抗体 ),另一种是标记材料( 如酶 )结合生物素后制成的标记物。 ( 二 ) 标记方法 1.标记抗体、抗原 抗体是常用的生物活性大分子物质。由于一个抗体分子可连接多个生物素分子 , 因此一个生物素化的抗体分子在反应时可与多个亲和素分子结合 常用于标记抗体的活化生物素是 BNHS，但对于分子偏酸性的抗原 , 标记时多采用 BHZ。 2.标记酶 可标记HRP、β半乳糖昔酶 (β-Gal) 和碱性磷酸酶 (AP)。 (三) 标记注意事项 应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类 ( 氨基、醛基或巯基 ) 以及分子的理化性质 (酸性、中性或碱性), 选择相应的活化生物素和反应条件。 标记反应时, 活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例, 使每个蛋白质分子上标记的生物素分子数量控制在一定范围, 以免影响标记物的活性。 为减少生物素标记蛋白质后, 大分子物质造成的空间位阻影响, 有利于生物素与亲和素的结合, 可在生物素与被标记物间加入交联臂样结构。 生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后, 不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同, 对 HRP、葡萄糖氧化酶和β半乳糖苷酶, 酶活性不受偶联生物素的干扰, 但某些酶(如碱性磷酸酶)在标记生物素后, 其活性会有一定程度降低。 第三节 亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记 一、亲和素及其活性 亲和素富含的色氨酸与其活性密切相关 , 是亲和素与生物素咪瞠环酬结合的基团。 二、链霉亲和素及其