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* 酵母的双杂交系统示意图 * 该法是一种用于分离和鉴定差异表达基因的方法,特别适宜于那些差异表达量很低的基因,其富集效率在1000倍以上. 主要步骤： i. 利用SMART或常规方法制备待测ds-cDNA（tester cDNA）和驱动ds-cDNA（driver cDNA） ii. 用限制酶RsaI酶切2种Cdna,获得具有平端结构的ds-cDNA片段 iii. 将待测cDNA样品分为两份,分别与2种不同的匹配接头相连接.两接头的5’端序列是相同的,而其3’端则是不同的 7. 抑制消减杂交法（SSH, Suppression Substraction Hybridiazation) * iv. 每份待测cDNA样品中加入过量的驱动cDNA,加热变性后再复性,形成a、b、c、d 4种分子,a类分子包括等量的高丰度和低丰度序列.由于非目的DNA已与驱动cDNA形成了c类分子而使差异表达的基因序列大大地富集了—第1轮PCR v. 将第1轮杂交的样品进行第2轮杂交:将2种样品混合后再加入驱动cDNA,被富集的a类分子可形成b、c、e等3类杂交分子,e类分子是由2个具有不同单链匹配接头的双链待测cDNA组成,该类分子是被大大富集了的差异表达基因 vi. 整个群体分子经过第2轮PCR反应:补平末端和差异表达基因的扩增vii. 扩增结果:a、c和d分子因未形成双链或只有单端引物,而b类分子可形成锅柄状分子,因而无法进行PCR扩增,只有e分子才能被扩增 * First, a DNA target sequence (the bait) is inserted into pHIS2, the reporter plasmid, which encodes the nutritional marker HIS3. Second, a cDNA library is synthesized using the BD SMART reagents provided. Third, yeast strain Y187 is cotrans-formed with the library, the pHIS2 reporter, and Sma I-linearized pGADT7-Rec2. To screen for positive one-hybrid interactions, spread the transformation mixture on selective medium and incubate (1). In vitro ligation and bacterial amplification are unnecessary because the cloning takes place in yeast via homologous recombination?another time-saving feature you won?t find in any other one-hybrid system. * 第五章 基因的分离 * 第一节 基因的分离 * ? 一. 获得基因的一般方法 1. 化学合成方法 主要用于较小基因的合成, 或需改变密码子的基因。 2. 半化学合成法 mRNA → cDNA → 加人工接头或合成一段DNA → 与载体相连 3. 筛选法 用于各种方法从基因组文库或cDNA文库中选择目的基因。 * 1. 遗传互补法 1)??原理 当把一外源DNA片段引入一受体细胞后, 如果受体细胞获得某种新的性状，那么此片段上携带着决定新性状的遗传基因。 i. 营养缺陷型:受体细胞+外源DNA → 转化细胞涂布在合成培养基上 → 原养型细胞生长 ii. 受体细胞:(无某种表型)+ 外源DNA → 转化细胞涂布在特殊培养基上 → 具有新性状细胞 iii. 虽然有些受体细胞也能产生某种酶活性, 但当转入目的基因后, 该细胞可过量产生此酶活性, 这亦可用于基因筛选。如酿酒酵母的MFα基因就是如此筛选到的。 二. 基因的筛选方法 * 实例：基因组文库DNA → 转化酿酒酵母细胞（leu2,Leu-）→ 转化细胞（leu2/LEU2,Leu+）→LEU2基因 基因组文库DNA →转化E.coli（无纤维素酶活性）→ 转化细胞可在纤维素平板上形成水解圈 →纤维素酶基因 优点:简便,快速,可靠,是首选方法. 获得的基因一定是完整基因. 缺点: 适