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target gene 目的基因 reference gene 内参基因 total RNA cDNA total RNA cDNA target gene 目的基因 reference gene 内参基因 qPCR qPCR 数据分析 荧光定量PCR实验流程 普通小鼠 转基因小鼠 相对定量数据分析 2-△△Ct 法 目的基因 OCT4 Ct值 内参基因 Actin Ct值 目的基因 -内参基因 ΔCt 实验样本 -对照样本 ΔΔCt 倍数值 2-△△Ct 对照样本 30.485 23.625 6.86 0 1 待测样本 27.025 22.66 4.365 -2.495 5.63728 2-ΔΔ Ct法 目标基因的Ct值-内参基因的Ct值 待测样本的ΔCt值-对照样本的ΔCt值 计算表达水平比率： 2 –ΔΔCt = 表达量的比值 主要内容 * 荧光定量PCR原理 荧光定量PCR实验流程 荧光定量PCR产品与技术服务 荧光定量PCR相关产品 RNA提取 逆转录 荧光定量 PCR Super RT逆转录酶 HiFi-MMLV逆转录酶 第一链合成试剂盒 一步法RT-PCR试剂盒 RNA样本保存液 TRIzon 超纯RNA提取试剂 动物组织/细胞、植物、血液、细菌、酵母系列专用RNA提取试剂盒 UltraSYBR Mixture FastSYBR Mixture GoldStar TaqMan Mixture RT-qPCR二步法试剂盒 RT-qPCR一步法试剂盒 荧光定量PCR系列产品 DNA提取 荧光定量 PCR 植物基因组提取试剂盒 动物组织、细胞基因组提取试剂盒 血液基因组提取试剂盒 土壤微生物基因组提取试剂盒 粪便基因组提取试剂盒 病毒DNA/RNA提取试剂盒 ……………………………………… UltraSYBR Mixture FastSYBR Mixture GoldStar TaqMan Mixture Housekeeping gene – 引物序列？反应条件？ 目标基因– 引物序列？反应条件？ 选择试剂，摸索条件，优化参数 – 两个月？ CoWin解决方案：全套qPCR服务 客户指定：物种，housekeeping gene，目标基因 客户提供：生物样本 客户得到：数据报告，剩余样品。 客户下游工作：写论文; 得诺贝尔奖 荧光定量PCR技术服务 荧光定量技术服务项目 荧光定量PCR服务项目 荧光定量PCR服务 相对定量 --SYBR Green 染料法 相对定量 --TaqMan 探针法 绝对定量 -- TA克隆制备标准品 miRNA荧光定量服务 miRNA荧光定量 -- 加尾法（SYBR Green法） miRNA荧光定量 -- 茎环法（SYBR Green法） miRNA荧光定量 -- 茎环法（TaqMan法） 技术服务流程 客户填写信息采集单 康为与客户签订项目定制单 康为按双方签定的定制单进行实验 康为提供实验报告 荧光定量PCR信息采集 * 实验目的： 用荧光定量PCR（SYBR Green法）法检测不同样本中OCT基因的表达差异。 信息采集：（客户填写信息采集单） 样本：名称、数量 （人？大鼠？小鼠？） 检测指标（几个基因？基因名称？） 定量方法：相对定量？绝对定量？ 检测方法：染料法？探针法？ 其他相关信息 荧光定量PCR实验方案 实验方案：（制定项目定制单 ） 服务项目 （目录号） 基本程序 验收标准 时间 （工作日） 引物合成（CWS010） 根据客户提供基因序列设计并合成引物 1周 RNA提取（CWS001） 对人的细胞样本进行RNA提取 RNA电泳图 1周 逆转录（CWS018） 将总RNA反转录成cDNA，以Oligo (dT)为引物 标准曲线R295%，融解曲线单峰 PCR条件检测和优化 优化PCR条件 1周 Real-Time PCR（CWS021） 用SYBR Green I染料法，Real-Time PCR（相对定量法）检测目的基因序列相对丰度，以人的actin为内参基因。 融解曲线单峰 4-5周 总计 7-8周 荧光定量PCR实验报告 实验报告： （向客户提交完整实验报告） 实验材料：（样本、试剂、仪器） 实验方案： 实验结果： RNA提取：RNA电泳图 Real-time PCR： 预实验结果：标准曲线、融解曲线 正式实验结果：扩增曲线、融解曲线 荧光定量PCR实验报告 RNA电泳图： Real-time 预实验 引物筛选结果 两对引物筛选结果对比 引物 扩增效率 溶解曲线 引物-1 95.36% 单峰 引物-2 7