仪器分析高效液相色谱.ppt

按固定相的聚集状态分类： 液-固色谱法 液-液色谱法 按分离机制分类： 分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法 空间排阻色谱法 其它分离机制色谱法： 亲合色谱法 AC 胶束色谱法 MC 手性色谱法 CC 毛细管电色谱法 CEC 第六节　毛细管电泳法Capillary Electrophoresis 1、毛细管区带电泳 CZE 2、毛细管凝胶电泳 CGE 3、 胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC） 例：毛细管电泳（抑肽酶） sigma抑肽酶对照品毛细管电泳谱图 原理：不同待测离子对固定相亲和力的差别 固定相： 基质：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶 表面键合离子：阳离子和阴离子交换树脂 四、离子交换色谱法（IEC） 流动相：一定pH和盐浓度的缓冲溶液 用途：适用无机离子、有机离子混合物的分离例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。 离子对AB具有疏水性，被非极性固定相提取 不同待测离子A1，A2…与B离子间成对能力不同，形成不同疏水性离子对，从而保留值不同 原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B加入到流动相中形成离子对AB，间接改变待测离子保留特性 五、离子对色谱法（IPC） 如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液 用途：主要用来分离强极性有机酸和有机碱 固定相： 化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料。 流动相： 作用不是为了控制分离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。 六、尺寸排阻色谱法（SEC） 常用流动相 ——四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水 原理：利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离。 凝胶过滤色谱： 以水或缓冲液作流动相 主要适合于水溶性高分子的分离 凝胶渗透色谱： 以有机溶剂作流动相 主要适合于脂溶性高分子的分离 用途 六、尺寸排阻色谱法（SEC） 特点： 固定相与分子间作用力趋于零，柱寿命长 相对分子质量差别必须大于10％才能分离 七、亲和色谱法（AC） 原理：利用生物大分子和固定相表面存在生化特异性亲和力，进行选择性分离 固定相：生物专一性配基+载体 流动相：一定pH的缓冲液 具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留；没有亲和力作用的分子不被保留。 用途： 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析 第四节 HPLC分离条件的选择 根据van Deemter方程和色谱分离方程式选择分析条件 在高效液相色谱中, 速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，而只有两项，即： H = A + C u （1）固定相： ①粒度小，均匀，以减小涡流扩散和流动相传质阻力； ②改进结构，采用大孔径和浅孔道的表面多孔型载体或全多孔微粒型载体，减少滞留流动相传质阻力。 第四节 HPLC分离条件的选择 （2）流动相： 低粘度的流动相——增大组分 在溶剂中的扩散系数Dm——减少传质阻力 （3）流速： 最佳流速在流速很小处，减小流速有利提高柱效 常采用比最佳流速高数倍的流速——加快分析速度 第四节 HPLC分离条件的选择 （4）柱温： 提高柱温——降低流动相粘度——减少传质阻力——分辨率降低，柱寿命短，易产生气泡， 一般在室温下进行 第四节 HPLC分离条件的选择 第五节 HPLC的建立与应用 一、建立HPLC分析方法的一般步骤 1、根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种HPLC分离方式。 材料来源、浓度范围 组分特性、结构、分子量、溶解性等  一、建立HPLC分析方法的一般步骤 一、建立HPLC分析方法的一般步骤 2、选择合适的分析方法 适用的色谱柱：柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径） 流动相 检测器 样品预处理 一、建立HPLC分析方法的一般步骤 3.分析条件的优化 流动相种类与配比 梯度 温度 流速 检测波长 进样量 一、建立HPLC分析方法的一般步骤 4、由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。 二、HPLC定性定量分析方法 1、定性分析 色谱鉴定法：保留时间对照 化学鉴定法：利用专属化学反应对分离 后收集的组分定性 色谱-光谱联用定性 非在线色谱光谱联用法： 色谱光谱联用仪 二、HPLC定性定量分析方法 2、定量分析 外标法：外标工作曲线法、外标一点法、外标二点法等 不需知道校正因子，但需进样量准确 内标法：内标工作曲线法、内标一点法、内标二点法、内标对比法 1、在食品分析中的应用 食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、矿物质等； 食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂、抗氧化剂等； 食品污染物分析：霉菌毒素、微量元素、多环芳烃等。