实验十七紫外吸收法测定核酸含量.PDF

实验十七 紫外吸收法测定核酸含量 实验原理 核酸、核苷酸、核酸的组成成份中都含有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基全含有共轭双键， 它能强烈吸收 250—280 毫微米波段的紫外光。最大吸收在 260 纳米左右。 利用核酸吸收紫外光的性质，在核酸研究工作中解决了两方面的问题。` 一、 通过吸收光谱的分析推测出结构特点。如早期研究糖苷键位置时，通过对比紫 外吸收光谱的方法，确定糖苷键联接方式。腺嘌呤核苷和次黄嘌呤核苷的紫外吸收光谱 与 9— 甲基腺嘌呤和9— 甲基次黄腺嘌呤的紫外吸收光谱极相似，但却与 7— 甲基衍生物 的紫外吸收光谱显著不同。同样，鸟嘌呤核苷和黄嘌呤核苷的紫外吸收光谱与 9— 甲基 衍生物的紫外吸收光谱相似，但与 7— 甲基衍生物的紫外吸收光谱不同。由此可知自然 界中存在的嘌呤核苷为 9—糖苷键。 二、 通过紫外光吸收值的测定既可定性又可定量地计算核酸含量。 在定性鉴定各核苷酸类物质时，可测定它们在几个特定波长下的紫外吸收值，然后根据 其 OD 比值（250nm/260nm、280nm/260nm、290nm/260nm ）来判断为何种核苷酸。 还可以用紫外灯确定嘌呤和嘧啶衍生物在纸层析谱和电泳谱上的位置。 定量测定核酸类物质，可根据在特定波长下的紫外吸收值计算出含量。 核酸和核苷酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用 k(P)260nm 来表示，k(P)260nm 为每升溶 液中含有 1 摩尔核酸磷的光吸收值。RNA 的k(P)260nm （pH7 ）为7700～7800 。RNA 的 含磷量约为 9.5%，因此每毫升溶液含 1µgRNA 的光吸收值相当于 0.022～0.024 。小牛 胸 腺 DNA 钠盐的 k(P)260nm （pH7 ）为6600，含磷量为 9.2%，因此每毫升溶液含 1µgDNA 钠盐的光吸收值为 0.020 。 由于核酸中的碱基在不同pH 下发生互变异构，由此引起紫外吸收光谱也发生改变。 因而碱基、核苷酸的克分子消光系数在不同波长处随 pH 的变化而不同。所以在测定紫 外吸收值与定量计算时应固定 pH 。不仅溶液中的 pH 值影响核算的克分子消光系数， 还有其他因素对核酸的克分子消光系数有影响。如不同浓度氯化钠溶液的 DNA 的吸收 系数作用。k(P) 随盐浓度增大而变化。还有乙醇，也可能使 k(P)增大，50%乙醇对此作 用最大，较浓的或较稀的乙醇对 k(P)有降低作用。因此用紫外吸收测定核酸的含量时要 注意这些问题。 蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收在 280nm 处，在 260nm 处吸收值仅为核酸得十分之一或更低，故样品中蛋白质含量较低时对核 酸的紫外测定影响不大。RNA 的260nm 与 280nm 吸收比值在 2.0 以上，DNA 的260nm 与 280nm 吸收的比值则在 1.9 左右。当样品中蛋白质含量较高时，比值即下降。 试剂和器材 1、 试剂 （1） 钼酸氨— 过氯酸沉淀剂[0.25%钼酸氨—2.5% 过氯酸溶液] ：取 3.6ml70%过氯酸和 0.25g 钼酸氨溶于 94.6ml 蒸馏水中。 （2 ） 样品RNA 或 DNA 干粉。 （3 ） 5—6%氨水：浓氨水稀释 5 倍。 2 、 器材 （1） 容量瓶（50ml ） （2 ） 离心管 （3 ） 离心机 （4 ） 紫外分光光度计 操作方法 将样品配制成每毫升含 5～50µg 核酸的溶液，于紫外分光光度计上测定 260nm 和 280nm 吸收值，计算核酸浓度和两者吸收比值。 RNA 浓度（µg/ml）= （A260nm/0.024×L ）稀释倍数