实验十二离子交换柱层析分离核苷酸 - 四川大学生物科学实验教学中心.DOC

实验八 离子交换柱层析分离核苷酸 一、实验目的 本实验以酵母RNA为材料，将RNA用碱水解成单核苷酸，再用离子交换柱层析进行分离，最后采用紫外吸收法进行鉴定。同时通过测定各单核苷酸的含量，可以计算出酵母RNA的碱基组成。 本实验的目的是： 1. 了解掌握RNA碱水解的原理和方法 2. 掌握离子交换柱层析的分离原理和方法 3. 熟练掌握紫外吸收分析方法 二、实验原理 1. RNA的碱水解 实验室制备单核苷酸一般用化学水解法（酸、碱水解）和酶解法。RNA用酸水解可得到嘧啶核苷酸和嘌呤碱基；用碱水解可得到2一核苷酸和3一核苷酸的混合物；用5一磷酸二酯酶或3一磷酸二酯酶水解则分别可得到5一核苷酸或3一核苷酸。 RNA用碱水解，经过2、3一环核苷酸中间物，而后水解生成2一核苷酸和3一核苷酸。如下图所示。 碱水解一般采用0.3M的KOH，37℃保温18~20小时就能水解完全（也可以用1M KOH，80℃水解60min或0.1M KOH 100℃水解20min）。水解毕，用2M HClO4中和并逐滴调节至pH=2左右，生成的KClO4沉淀，离心去除之。上清液即为各单核苷酸的混合液。然后根据所选离子交换剂的类型，将上清液调至适当的pH值，作样品液备用。一般用阳离子交换剂，pH调至1.5左右，用阴离子交换剂，pH调至8 ~ 9(逐滴)。此处用KOH是为了便于除去钾离子以降低样品溶液中的离子强度。 2. 单核苷酸的离子交换柱层析分离 离子交换层析是根据各种物质带电状态（或极性）的差别来进行分离的。电荷不同的物质对离子交换剂有不同的亲和力，因此，要成功地分离某种混合物，必须根据其所含物质的解离性质，带电状态选择适当类型的离子交换剂，并控制吸附和洗脱条件（主要是洗脱液的离子强度和pH值）,使混合物中各组分按亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱下来。 在离子交换层析中，分配系数或平衡常数（Kd）是一个重要的参数： Kd = Cs / Cm 式中：Cs是某物质在固定相（交换剂）上的摩尔浓度，Cm是该物质在流动相中的摩尔浓度。可以看出，与交换剂的亲和力越大，Cs越大，Kd值也越大。各种物质Kd值差异的大小决定了分离的效果。差异越大，分离效果越好。影响Kd值的因素很多，如被分离物带电荷多少，空间结构因素，离子交换剂的非极性亲和力大小，温度高低等。实验中必须反复摸索条件，才能得到最佳分离效果。 核苷酸分子中各基团的解离常数（pK）和等电点 p I 值见表1。 表 1 四种核苷酸的解离常数（pK）和等电点pI值 核苷酸 第一磷酸基 pKa1 第二磷酸基 pKa2 含氮环的亚氨基（－NH( =） pKa3 等电点 pI值* 尿苷酸UMP 鸟苷酸GMP 腺苷酸AMP 胞苷酸CMP 1.0 0.7 0.9 0.8 6.4 6.1 6.2 6.3 2.4 3.7 4.5 1.55 2.35 2.65 *注：pI = (pKa1 + pKa3) / 2 由表1可见,含氮环亚氨基的解离常数（ pK ）值相差较大，它在离子交换分离四种核苷酸中将起决定作用。 用离子交换树脂分离核苷酸，可通过调节样品溶液的pH值使它们的可解离基团解离，带上正电荷或负电荷。同时减少样品溶液中除核苷酸外的其它离子的强度。这样，当样品液加入到层析柱时，核苷酸就可以与离子交换树脂相结合。洗脱时，通过改变pH值或增加洗脱液中竞争性离子的强度，使被吸附的核苷酸的相应电荷降低，与树脂的亲和力降低，结果使核苷酸得到分离。 混合核苷酸可以用阳离子或阴离子交换树脂进行分离。采用阳离子交换时，控制样品液pH值在1.5，此时UMP带负电，而AMP、CMP、GMP带正电，可被阳离子树脂吸附。然后通过逐渐升高pH值，将各核甘酸洗脱下来，次序是UMP-GMP-CMP-AMP。AMP与CMP洗脱位置的互换，是由于聚苯乙烯树脂母体对嘌呤碱基的非极性吸附力大于对嘧啶碱基的吸附力造成的。 本实验采用聚苯乙烯一二乙烯苯三甲胺季铵碱型粉末阴离子树脂（201×8）分离四种核苷酸.首先使RNA碱水解液中的其它离子强度降至0.02以下，然后调pH值至6以上，使样品核苷酸都带上负电荷，它们都能与阴离子交换树脂结合。结合能力的强弱，与核苷酸的pI