第13章核酸的物化性质.PPTVIP

核酸的一般物理性质 DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体，都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。（用乙醇从溶液中沉淀核酸） DNA和RNA在细胞中常以核蛋白形式存在，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。 DNA核蛋白 RNA核蛋白 0.14mol/LNaCl - + 1-2mol/LNaCl + - DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。 核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。 一、核酸的水解 核酸分子中的N-糖苷键和磷酸酯键都可被水解。 （一）核酸的酸解 糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解， 水解的难易顺序为：磷酸酯键糖苷键 嘧啶碱的糖苷键嘌呤碱的糖苷键 嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键最易水解。 如，DNA在pH 1.6于37℃对水透析即可完全除去嘌呤碱，。 嘧啶糖苷键的水解常需要较高的温度。用甲酸（98％-100%）密封加热至 175℃ 2h，无论 RNA或DNA都可以完全水解，产生嘌呤和嘧啶碱。 （三）核酸的酶解 三、核酸的紫外吸收 在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240-290nm之间有强吸收峰，在260nm左右有最大吸收峰。可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据。 对于纯的DNA或RNA，可测定A260 双螺旋DNA含量（μg/mL）=A260?50 单链DNA含量（μg/mL） =A260?40 寡核苷酸含量（μg/mL） =A260?20 纯度的判断：测定A260/ A280的比值，纯DNA比值1.8 纯RNA比值≥2.0 四．核酸的变性、复性与杂交 （一） 核酸的变性（denaturation） 核酸的变性——指核酸双螺旋区的碱基之间的氢键断裂，变成单链的过程。 能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。 RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有DNA那样明显。 利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。 因为天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸收(260 nm)值增加25－40%.而RNA变性后，约增加1.1%。 DNA变性后的表现 A260值增加 粘度下降 浮力密度增大 分子量不变 DNA的热变性和解链温度（Tm） 用加热的方法使核酸变性叫做热变性。 DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为DNA熔解温度或熔点，用Tm 表示。一般DNA的Tm值在82-95?C之间。 DNATm的影响因素： （1）DNA的均一性。均质DNA，如一些病毒DNA，人工合成的poly(A-T)、 poly(G-C) 的熔解过程发生在一个较小的温度范围内；异质DNA的熔解过程发生在一个较宽的温度范围内。 Tm大小可反映出DNA的均一性。 （二）核酸的复性 变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复性后，一系列物理、化学性质将得到恢复。DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。 将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性，这一过程也叫退火（annealing)。分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。 复性反应的速度用Cot1/2表示。Co为变性DNA复性时的浓度，t为时间，以秒表示。 DNA复性 （三）核酸的杂交（hybridization） 热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构。 这样形成的新分子称为杂交DNA分子。DNA单链与互补的RNA链之间也可以发生杂交。 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。 Southern blotting(Southern 印迹) Northern blotting(Northern 印迹) Western blotting(Western 印迹) * * 第14章 核酸的理化性质 （二）核酸的碱解 常用的碱有NaOH、KOH等，主要水解磷酸酯键。以KOH效果最好。 RNA较