前列腺特异膜抗原基因的克隆与表达.pdfVIP

前罗口腺特异膜抗原基因的克隆与r表达 摘要 原的基因转染DCs，有可能使DCs持续表达全长蛋白，延长体内的抗原提呈： 以MHC．I类分子的形式，也可能以MHC—11类分子的形式，同时提呈多个或不 同的抗原表位，产生多种特异性CTLs，抗肿瘤免疫应答效果显著；本实验获得 了有效的肿瘤抗原靶基因，为研究基因转染的DCs疫苗提供了必需的条件。 【目的】 构建PSMA真核表达系统，为基因修饰的前列腺癌DCs疫苗提供物 质基础。 【方法】 回收纯化，用T4连接酶连接，转化用氯化钙法制备的感受态大肠杆菌DH5 n。从氨苄青霉素阳性的LB转化平板上随机挑取单菌落，增菌并提取质粒，进 行PCR鉴定和酶切鉴定，含有目的片断的为阳性重组子，采用自动序列分析仪 对PSMA．pcDNA3插入片段进行序列测定。 采用无菌操作提取并纯化PSMA—pcDNA3质粒，用脂质体转染法转染人前列腺 癌细胞系PC一3，转染后24小时用0418 300tag／ml选择培养基培养，对G418 抗性克隆用RT-PCR方法筛选鉴定阳性克隆，扩大培养阳性克隆，获得稳定生长 u 并表达PSMA目的蛋白的阳性克隆细胞株，200 g／ml维持筛选。用间接免疫荧 光法检测转染表达PSMA蛋白在细胞中的位置。提取细胞总蛋白，用Western Blotting法鉴定转染细胞表达PSMA蛋白的分子量。 【结果】 前列腺癌组织中提取的总RNA经RT—PCR扩增，O．8％琼脂糖凝胶电泳 可见一条特异性条带，位置在2000 000 bp和3 bp之间，其大小与预计片段大小 基本一致，而阴性对照未见任何条带。阳性重组子经PCR扩增后琼脂糖凝胶电 泳可见目的条带，经双酶切后显示目的条带和5．4kb的pcDNA3．0条带。序列测 个硷基不同，其中2个硷基所在密码子编码的氨基酸存在差异。 II 竺型竺竺墨竺苎墨兰望竺苎竺兰墨苎———————翌 用脂质体转染法将重组质粒转染人前列腺癌细胞系PC一3，经筛选和鉴定 得到两株稳定表达PSMA的阳性转染细胞克隆，RT-PCR证实转染细胞内存在 mRNA的转录，间接免疫荧光法检测到转染细胞表达PSMA为膜蛋白， PSMA Western kD，与标准细胞株 Blotting法证实转染细胞表达蛋白的分子量为100 LNCaP表达的PSMA分子量一致。 【结论】 1． 断的序列正确。 2． 构建了Ps姒真核表达载体，建立了稳定表达PSMA的细胞株。 3． 经免疫分析，证实了真核细胞内表达的PSm为分子量正确的膜蛋白，且 具有良好的抗原性。 4． 所获得的PSM,A真核表达系统为基因修饰的DCs疫苗治疗前列腺癌提供 了物质基础。 关键词：前列腺特异膜抗原逆转录一聚合酶链式反应基因克隆真核 表达载体 Ill 苎型竺竺兰竺苎墨兰里竺查竺兰查兰——————————立!三 and ofhuman Expression Cloning membrane antigen Major：Immunology Shu-Qiu Postgraduate：Did Kai-Yuan