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　　激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的应用论文 关键词： 激光；共聚焦显微镜；粘附细胞分析与筛选（ACAS） 摘 要 激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图象分析仪器，现已广泛应用于荧光定量测量、共焦图象分析、三维图象重建、活细胞动力学参数监测和胞间通讯研究等方面。其性能为普遍光学显微镜质的飞跃，是电子显微镜的一个补充。本文以美国Meridian公司的ACAS ULTIMA312为例简要介绍了激光扫描共聚显微镜系统的结构，功能和生物学应用前景。 关键词 激光；共聚焦显微镜；粘附细胞分析与筛选（ACAS） The Laser Scanning Confocal Microscopy System and its Biological Applications Chen Yaoedical image analysis instrument ,easurement ,conpocal image andlyusis ,3-D reconstruction ,Kiic signal monitioring of living cell ,cellcell munication researches ,etc .In this paper ,ACSA ULTIMA 312(Meridian Co,.freelple to introduce the principle of confocal microscopy ,its fuions and biological applications. Key ，扫描面积最大的为10cm×8cm，当激光逐点扫描样品时，针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，并将之转化为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚聚焦图像。一个微动步进马达控制栽物台的升降，使焦平面依次位于标本的不同层面上，可以逐层获得标本相应的光学横断面的图像。这称为“光学切片”。再利用计算机的图像处理及三维重建软件。可以得到高清晰度来表现标本的外形剖面，十分灵活、直观地进行形态学观察。 2、激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件系统 2.1 ACAS ULTIMa 312硬件及参数指标 激光光源：氩离子激光（50mHz PCI/80MB RAM/2000MB SCSI硬盘/150MB Bernoulli盘驱动器/17’’大屏幕显示器。 共聚焦系统：计算机自动控制光路准调节；计算机控制孔径校准；计算机调节孔径大小；自动Z轴调节（最小0.1μm）。 光学探测系统：3个测窗式PMT采集荧光；1个CCD系统；12位的高速A/D转换器。 图像分辨率：图像大小1535×1535；像素最小距离：0.1μm；灰度为4096级。 扫描方式：快速镜扫描Dual Scan台阶扫描；扫描精度0.1μm；扫描面积最大为10cm×8cm ；扫描平面：XY和XZ和独特点、线、面扫描。2.2激光扫描共聚焦显微镜软件系统 ACAS ULTIMa 312系统采用独特设计的软件将激光细胞仪与先进的计算机技术结合，产生快速、高效、灵活的操作系统，完备的数据采集、分析与管理功能。基于生物医学研究有如下的软件。 Image Analyze—对于单色、比色和三色标记的二维荧光图像的定量分析，可产生透射光图像重叠，同时Auto Image可多个区域的自动扫描和荧光定量，以及相同区域的时间顺序扫描。 Ratio Analysis和 Kiics—测定细胞内的离子变化，可有点扫描、线扫描及图像扫描三种测定形式，以监测各种速率的生物反应。 Cell –Cell munication and FRAP-相邻细胞的FRAP分析。该软件首先用可光淬灭特异的细胞荧光，然后在多个时间点扫描，此扫描可对单一区域或细胞的多个选择区域，可产生透射光图像并与其它图像重叠。 Cell List—储存被选择细胞的位置，即可自动对较大样品进行扫描，又可产生较小样品特异部位的网络位置表，以进行自动的测量、筛选和重复测定。 Cell Sorting—ACAS具备如下四种分选方式： Ablation Sort:预选定义一个荧光阈值 ，然后对特定细胞杀伤。②CookieCutter Sort在用户定义的中心点四周切割Cookies。③Quick Sort：对已定义的细胞表列，用Ablation或Cookie Cutter作分选。④Manual Sort：直接使用鼠标控制载物台位置及激光脉冲，并杀灭和分选细胞，进行细胞显微外科，染色体切割和光隐阱等操作。 Confocal Imaging—共聚焦分析，可实现Z轴定量，三维立体图像分析（包括SFP模拟荧光处理法，DP深度投影法和SP文体投影法），以及视点移动动画。 3 激光扫描共聚焦显微镜在细胞生物学中的应用