特异性沉默Eca109细胞系stathmin基因siRNA表达载体的构建论文.docVIP

　　特异性沉默Eca109细胞系stathmin基因siRNA表达载体的构建论文 王峰，王留兴，王瑞林，樊青霞，赵培荣 【摘要】 目的构建并筛选特异性沉默stathmin基因的pSUPERS逆转录病毒载体以及稳定表达的细胞克隆。方法用DNA重组技术，将64nt能转录产生靶向stathmin小发夹RNA（shRNA）的寡核苷酸序列，定向克隆入逆转录病毒载体pSUPEREGFP，应用脂质体将重组逆转录病毒载体pSUPERS转染细胞系Eca109.freelin mRNA的表达。结果重组逆转录病毒载体经EcoRⅠ、Hind Ⅲ双酶切，可见4692 nt和285 nt条带；测序结果表明插入序列正确；重组载体转染Eca109细胞，可表达绿色荧光蛋白（EGFP），经G418筛选得到抗性细胞克隆，转染细胞stathmin mRNA的表达较对照组明显减弱。结论特异性沉默stathmin基因的pSUPERS逆转录病毒载体以及稳定表达的细胞系构建和筛选成功。 【关键词】 小干扰RNA；stathmin基因；pSUPEREGFP载体；Eca109细胞 Abstract：Objective To construct and identify a rebinant retroviral vector pSUPERS that target stathmin gene and a stable virusproducing cell line.MethodsThe 64nt encoded targeting stathmin gene shRNA sequence e digestion and DNA sequencing. The packaging cell Eca109 id using liposomebased transfection and the stable intergrant edium.The expression of stathmin mRNA ents, 4692 nt and 285 nt, respectively. The result of sequence demonstrated that 64nt had been inserted into the vector. Green fluorescent protein （EGFP）in gene in gene and a stable virusproducing packaging cell line all interfering RNA; stathmin gene; pSUPEREGFP vector; Eca109 cells 0引言 食管癌是常见的恶性肿瘤之一。某些基因的异常表达与肿瘤发生、发展密切相关。Stathmin为一种高度保守的细胞内蛋白，在多种恶性肿瘤细胞中高表达，研究表明1,2 通过应用反义核酸、单克隆抗体、核酶、stathmin蛋白抑制剂及丝氨酸位点突变体等方法封闭该基因表达，可使细胞受阻于G2／M期，同时使恶性肿瘤表型发生逆转。stathmin成为恶性肿瘤生物治疗的新靶点。RNA干扰是最新的基因敲除技术，具有高效性和特异性，能够降解相应的细胞内mRNA，使基因转录后沉默3。本研究应用含H1启动子的逆转录载体pSUPEREGFP构建了stathmin基因的siRNA表达载体pSUPERS，稳定转染Eca109细胞，以特异性沉默目的基因的表达，观察小干扰RNA（siRNA）对靶基因表达的抑制作用，探讨肿瘤基因治疗的新模式。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1细胞系和质粒人食管癌细胞Eca109、大肠杆菌JM109为郑州大学肿瘤中心保存;pSUPEREGFP质粒由郑州大学基础医学院丁一教授惠赠，靶向stathmin的64nt oligos由上海生物工程公司合成。 1.1.2试剂限制性核酸内切酶BglⅡ、EcoRⅠ、Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶和Trizol试剂购自Promega公司; DNA Marker、DNA Purification kit和RTPCR检测试剂盒购自大连宝信生物工程公司；脂质体转染试剂Lipofectine 2000和G418购自美国Invitrogene公司。 1.2方法 1.2.1靶向stathmin基因寡核苷酸的设计应用美国Oligo Engine公司提供的双链RNA（siRNA）设计软件，选择合适的19 nt靶序列，通过Blast搜索确认与人的其他基因序列无同源性。该19 nt的序列分别为：5′GAAAGACGCAAGTCCCATG3′，5′ACGAGAGCACGAGAAAGAA3′，由上海生物工程公司合成两条64nt的互补单链，序列见表1。