磁纳米探针检测人绒毛膜促性腺激素论文.docVIP

　　磁纳米探针检测人绒毛膜促性腺激素论文 刘儒平 刘军涛 王蜜霞 罗金平 刘春秀 蔡新霞 【摘要】 采用链霉亲和素包被磁纳米粒子，将生物素标记的特异性抗体偶联在磁纳米粒子上，制备出高特异性的磁纳米探针；利用此探针对人绒毛膜促性腺激素（HCG）进行测定，建立了定量检测蛋白类激素的化学发光分析方法。利用紫外可见分光光度计、透射电镜及动态光散射仪对磁纳米探针进行表征，同时对化学发光实验条件进行优化。在2×10－4 mol/L鲁米诺、8×10－4 mol/L H2O2, pH=13的优化条件下，将磁纳米探针用于HCG的定量检测。结果表明，所测发光强度与待测HCG浓度之间线性相关，相关系数r为0.9924.freelan chorionicgonadotropin，HCG）是一种蛋白类激素，绒毛膜癌、葡萄胎等疾病的治疗均需对HCG进行定量测定6。目前，用于定量检测HCG的方法有放射免疫法和酶联免疫法。放射免疫法具有敏感度高、特异性好等优点，但却存在放射性污染的缺点；酶联免疫法不存在放射性污染问题，但灵敏度相对较低， 定量测定范围较窄7。本研究采用磁纳米探针检测微量蛋白类激素，综合了化学发光法灵敏度高、线性范围广、测定速度快，以及酶联免疫法的特异性高、准确性好的优点，同时利用磁性微粒在磁场中可控运动的特点，将待测物快速富集，具有更快的检测速度8。此种磁纳米探针初步应用于临床标本的检测，取得了良好的效果。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 F4500荧光光谱仪（日本日立公司）； 123.20D DynaMagSpin磁分离器（挪威Dynal公司）； SI0146 VortexGenie旋涡混合器（美国科技仪器有限公司）； 20/20n化学发光多功能光度计（美国Promega公司）； UV2250 PC紫外可见分光光度计（日本岛津公司)； 802型动态激光光散色仪（美国Viscotek公司）； ZHB，万泰生物药业）；磁性颗粒（陕西北美基因股份有限公司）；其它试剂均为分析纯，实验用水为二次去离子水。 2.2 实验方法 2.2.1 磁纳米生物探针的制备 取25 μL生物素标记的鼠抗αHCG抗体（3 g/L），加入350 μL PBS缓冲液（pH 7.4），配制成抗体溶液。采用缩合反应将链霉亲和素偶联在磁纳米粒子上9～11，将100 μL链霉亲和素修饰的磁纳米粒子工作液（5 g/L）与该鼠抗αHCG抗体溶液混匀，置于37 ℃，150 r/min 的恒温摇床中反应30 min，利用生物素和链霉亲和素之间的高亲和力将生物素标记的特异性抗体偶联在磁性纳米粒子上，制备成具有高特异性的磁纳米探针。探针洗涤后加入500 μL封闭液（0.05% Proclin 300与10%酪蛋白的TrisHCl缓冲液），在37 ℃，180 r/min恒温摇床中振荡30 min后磁性分离。用PBS缓冲液清洗后，加入PBS缓冲液配制成浓度为1 g/L的磁纳米探针溶液，置于4 ℃避光保存，备用。 2.2.2 磁纳米探针的表征 采用紫外可见分光光度计测定标记前的鼠抗αHCG抗体溶液(Pre)、标记后的上清液(Post)及标记过程中清洗液（）观测磁纳米探针的形貌。 2.2.3 磁纳米探针用于HCG浓度的测定 采用双抗体夹心法，利用制备的磁纳米探针对HCG样品进行定量检测。将HCG磁纳米探针、待测HCG样品溶液、HRP标记的鼠抗人βHCG抗体置于离心管中，使三者充分混合，然后置于37 ℃摇床反应25 min，形成磁纳米探针待测HCG抗原酶标抗体的复合物，在磁性分离区域用PBS缓冲液进行洗涤，并采用单因数法对化学发光体系的实验条件进行优化。在优化实验条件下，在上述复合物中加入化学发光底物液（鲁米诺与H2O2），酶催化底物发光，用20/20n单光子计数仪检测光强，通过光强与待测物浓度的对应关系计算样品中HCG的浓度。 3 结果与讨论 3.1 磁纳米探针的表征 采用紫外可见分光光度计在280 nm处测得标记前的鼠抗αHCG抗体溶液吸光度ODpre(280)=1.755、标记后的上清液吸光度ODpost(280)=0.30、 标记过程中清洗液吸光度∑ODage of the magic nanoparticle probes 采用透射电子显微镜对磁纳米探针的形貌特征进行描述。如图1所示，合成的磁纳米探针具有良好的单分散性。 使用激光动态光散射仪来测定磁纳米探针制作前后的平均粒度及粒度分布范围，结果分别如图2a和图２b所示，实验数据见表1。 图2 亲和素包被磁纳米粒子(a)和磁性纳米探针（b）的粒径分布（略） Fig.2 Size distribution of streptavidinlabeled magic nan