紫外分光光度法的原理.ppt

第七章 紫外分光光度法的原理和应用 一. 比色分析的原理：光是一种电磁波，它的波长用nm或?为单位，人的眼睛所能感觉到的光波长约400～760 nm，这之间的光波称为可见光。短于400 nm的叫紫外线，短于200nm的叫远紫外线，再短的就是X射线和γ射线了。长于760nm的叫红外线，红外线可长达5mm，再长的就是无线电波了。 普通的日光、白炽灯光称为发射光，将这种日光或白炽光通过棱镜可以分解为红、橙、黄、 绿、蓝、青、紫等组成的光谱，称为发射光谱。如果在白炽灯光与棱镜之间放一个有色溶液的玻璃皿，则通过棱镜后的光谱上会出现一处或几处暗带，这种带有暗带的光谱称为该有色溶液的吸收光谱，吸收光谱显示该溶液对光的选择性吸收的特性。溶液所呈现的颜色是它的吸收光谱中透过最多、吸收最少的那部分波长光线的颜色，而暗带部分则是它透过最少、吸收最多的那部分波长光线的颜色。 不同分子的原子团和原子，它的发射光谱和吸收光谱不同。因此可以根据其光谱的特征和 强度研究化合物的结构和测定其含量，称为光谱分析法，这也是比色分析的原理。根据发射光谱分析的如火焰发射光谱法（又称火焰光度法，分析钠、钾、钙），荧光光度和荧光分光光度法（根据荧光的发射强度进行分析）。 根据吸收光谱分析的方法又称吸光光度法，如应用可见光的吸收光谱进行分析的普通的分光光度计和分光光度法；用紫外光的吸收光谱进行分析的叫紫外分光光度计和紫外分光光度法；用原子的吸收光谱进行分析的方法叫原子吸收分光光度计和原子吸收分光光度法。 硒-邻苯二胺络合物的吸收光谱特征吸收峰332.5nm 氧化钬的吸收光谱 二. 郎伯-比尔定律：当一束单色入射光[ I0]通过厚度为L、浓度为C的有色溶液后，所透过光的强度[ I1 ]与溶液厚度L及浓度C成负指数乘积的关系：I1=I0·10－K·L·C 如果物质在溶液中的浓度和显色强度成正比，则可以应用郎伯-比尔定律通过比色方法从显色强度求浓度，这是比色分析的原理。 入射光强度I0 透过光强度I1 溶液厚度L（比色杯直径） I1=I0·10－K·L·C移项成：I1/I0=10－K·L·C 式中K为常数，可因物质的吸光特性和采用单色光的波长不同而有所不同，与溶液的厚度和浓度无关。上式写成以10为底的对数，Iog(I1/I0)=－K·L·C，再以透光度T=I1/I0时，则上式成为IogT=－K·L·C或者－IogT=K·L·C。I1/I0称为透光度或透光率，表示透过光强度是入射光强度的百分之几，其数值只能＜1，从0~100%。为了方便起见，经常用透光度的负对数－IogT来表示溶液吸收光线的情况，并称为吸光度(ABS)、消光度(E)、或光密度(OD或D)，这样，ABS= K·L·C 该式说明溶液的吸光度和浓度C、厚度L之间皆成正比关系。当厚度一定时，溶液的浓度增加，则吸光度成正比地增加，这就是比色分析的依据。实际使用中，溶液的厚度就是比色杯的厚度，它是相对固定的，有0.5、1、2、4cm的比色杯，使用最多的是1cm的比色杯。 比色分析中有时也用透光度做单位，根据透光度的负对数－IogT=吸光度，透光率为100%时，吸光度=－Iog1=0，而透光率为1%时，吸光度=－Iog0.01=2，二者间呈对数指数关系。 当然，只有溶液的浓度和吸光度之间成直线 正比关系时才能进行比色分析，如果溶液的吸光度与浓度不成正比（不符合郎伯-比尔定律），则不能使用比色分析。有时，溶液的浓度只在一定范围内和显色成直线正比关系，而浓度超过一定限度时，失去正比关系，则不能一概地用比色结果换算，通常都要研究测定方法中什么浓度范围内二者成直线正比关系；或者绘制一系列浓度和吸光度之间的标准曲线，发现浓度增加到一定限度，标准曲线发生弯曲、变折，说明超过该浓度时，要对溶液进行稀释才能用来比色分析。 可见光、紫外、荧光分析都要求溶液必须透明，否则引起对光的吸收，影响分析的准确度。 对特殊的均匀的浑浊液也可以进行比色分析,称为比浊法，比如应用于红细胞计数、细菌计数的比浊测定。 光线通过透明的溶液时，还有少量的光线在玻璃、溶液的表面被反射或散射，影响到吸光度，所以要用一个空白管进行校正，除去反射、光、散射光、试剂中杂质、非反应物的影响，即用空白试剂溶液进行调零的原因。普通玻璃对紫外线也有吸收，所以在普通分光光度计上 使用普通玻璃比色杯，而在紫外分光光度计上必须用对紫外线无吸收的石英玻璃比色杯。 三. 可见—紫外分光光度计的应用 （一）光谱分析：有时候需要研