突触内NMDAR通道电流在培养神经元发育中的变化论文.docVIP

　　突触内NMDAR通道电流在培养神经元发育中的变化论文 田映红， 胡德辉， 李树基， 陈明， 高天明 【摘要】 【目的】 观察培养大鼠海马神经元突触内NMDA受体（NMDAR）通道电流在发育中的变化。【方法】 取新生1 d SD大鼠海马制成细胞悬液，接种在培养板上进行培养。培养到1周和2周时，采用膜片钳全细胞模式记录神经元突触内自发的微小兴奋性突触后电流（mEPSC）。【结果】 培养2周海马神经元突触内NMDA受体介导的mEPSC（mEPSMDA）幅度比培养1周神经元小，对NR2B的特异拮抗剂ifenprodil的敏感性降低。Ifenprodil对培养1周神经元mEPSMDA的抑制作用达到（80.47±6.12）％.freelEPSMDA。【结论】 培养海马神经元突触内NMDA受体通道电流有发育变化，提示培养1周神经元突触内NMDA受体NR2亚单位主要为NR2B；而神经元培养到2周时，突触内NR2B亚单位逐渐被NR2A取代。 【关键词】 海马神经元； N-甲基-D-天冬氨酸受体； 膜片钳记录； 突触； mEPSC 甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）是中枢神经系统中谷氨酸受体的一种类型，主要由2个NR1和2个NR2亚单位组成。NR2分为4种亚型，分别是NR2A，NR2B，NR2C和NR2D，海马和皮层神经元主要是NR2A和NR2B。近年来的研究提示突触内和突触外NMDAR在突触可塑性、细胞内信号级联及兴奋毒方面的作用不同1-3，因此明确突触内、外NMDAR的亚单位组成对研究突触内、外NMDAR参与不同功能具有重要作用。以前的研究发现突触内、外NMDAR存在发育变化，但对突触内NMDAR在发育中变化的研究基本都采用全细胞模式记录诱发的兴奋性突触后电流（evoked-excitatory post-synaptic current, eEPSC）4，5。这种方法往往会激活一部分突触外NMDAR，并且不是真正意义上的生理活动，因此本文采用膜片钳全细胞模式记录培养1周和2周海马神经元突触内NMDAR介导的自发的mEPSC，同时利用NR2B的特异拮抗剂ifenprodil来观察培养海马神经元突触内NMDAR通道电流在发育中的变化，为探讨不同亚型NMDAR参与不同作用提供理论基础。 1 材料与方法 1.1 实验动物及试剂 新生1 d SD大鼠。试剂：DMEM/F12、neurobasal培养基(Gibico)；胎牛血清（杭州四季青公司）；乙二醇双(2-氨基乙基)四乙酸（EGTA，上海生工）；多聚赖氨酸、阿糖胞苷、胰蛋白酶、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、甘氨酸、荷包牡丹碱（bicuculline methiodide）、士的宁（strychine）、河豚毒（TTX）、ifenprodil、6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(QX)、2-氨基-5-磷酸基戊酸(d-APV)、钾盐（K2ATP）均为Sigma产品；余为国产分析纯。 1.2 方 法 1.2.1 大鼠海马神经元的分离和培养 新生1 d SD大鼠，分离海马并去除血管及脑膜，将海马剪成小块，经2.5 g/L胰蛋白酶作用15 min（37 ℃），用含胎牛血清的完全培养基（DMEM/F12）终止消化，吸管轻轻吹打组织块以分散细胞。将细胞悬液经400目尼龙网过滤，900 × g离心7 min，沉淀加完全培养基重悬，调细胞密度为1 × 106/mL，然后将细胞悬液加入事先包被多聚L-赖氨酸的培养板中，置于37 ℃，体积分数5％ CO2培养箱内培养。24 h后将完全培养基换成neurobasal培养基（含2％ B-27），并加入5 μmol/L阿糖胞苷以抑制胶质细胞增殖。以后每3 d换液1次。 1.2.2 膜片钳记录 原代海马细胞培养到6～7 d或13～15 d，用来进行膜片钳实验。所有实验均在室温下进行（22～25 ℃）。记录用的玻璃微电极用硬质厚壁玻璃拉成玻璃毛坯，再用P97微电极拉制器分3～4步拉制微电极，电极尖端直径为1 μm左右。用pClamp 9.0进行记录。记录到的信号经1～2 kHz低通滤波，并用digidata 1320进行10 kHz数字滤波。采集到的数据存入计算机以备以后分析处理。全细胞模式记录自发的mEPSC，钳制电压为-60 mV，玻璃微电极的充灌电阻为3～5 MΩ。浴槽液成分包括(mmol/L)：140 氯化钠, 5 氯化钾, 1.3 氯化钙, 25 N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）, 33 葡萄糖, 0.02 荷包牡丹碱 (抑制γ-氨基丁酸受体)，0.001 士的宁（抑制甘氨酸受体），0.001氨基酸，0.001 TTX（抑制动作电位），pH