简化的两步法细菌内同源重组腺病毒表达载体重组高效制备p53基因论文.docVIP

　　简化的两步法细菌内同源重组腺病毒表达载体重组高效制备p53基因论文 .freelv转移质粒上，转化DH5α筛选卡那霉素抗性菌落构建重组腺病毒转移质粒p shuttle-cmv-p53用Pmel酶切线性化采用两步法进行同源重组：先将腺病毒骨架质料pAdEasy-1转化氯化钙法制备的BJ5183感受态细菌.freelv-p53转化氯化钙法制备的AdBJ5183感受态细菌，在细菌内进行同源重组，挑选卡那霉素抗性菌落培养并提取质粒，琼脂糖电泳挑选大片断的重组质粒pAdBJ5183-P53分别用限制性内切酶PacI和BstXI及PCR法鉴定。结果 成功构建了p53基因重组腺病毒表达载体。结论 采用简化的两步氯化钙化学转化法可以取代电穿孔法高效构建重组腺病毒表达载体。 【关键词】 腺病毒载体；同源重组；p53基因 【Abstract】 Objective To construct rebinant replication-defective human adenovirus serotype 5 vector carrying plified tologous rebination protocol in bacteria.Methods v and the positive rebinant p shuttle-p53 eI.Then the simplified tologous rebination protocol ployed for the construction of rebinant adenoviral vector.In step one，adenoviral skeletal plasmid pAdeasy-1 ed into BJ5183 petent cells by calcium chloride chemical methed to obtain pAdBJ5183;and in step tid ed into pAdBJ5183.The possible positive adenoviral plasmids an p53 gene chloride chemically simplified tologous rebination protocol can replace the co-transformation by electroperforation and may have broaed utility in system that involve homologous rebination in bacteria. 复制缺陷型腺病毒可以高效介导基因的体内外转移；感染细胞范围广，不但可以感染分裂期细胞，也可感染静止期细胞；感染细胞时其DNA不整合到宿主细胞染色体中，安全可靠。因此成为基因治疗中常用的载体。重组腺病毒载体的构建方法有真核细胞内质粒重组法、酵母人工染色体克隆系统、Cre/loxp定点重组系统、末端蛋白-DNA复合物共转染法等［１～３］。以上方法牵涉到的步骤和环节较多、工作量大、实验周期长。1998年He等［4］建立了细菌内质粒共转化同源重组方法，该法简便快速、实验周期短，但是共转化需要电穿孔仪，且同源重组成功率不到20%。笔者在实际工作中对该法进行了改进，采用简化的两步氯化钙化学转化法代替电穿孔共转化法构建了p53重组腺病毒表达载体。 1 材料与方法 1.1 实验材料 pAdEasy-1、pshuttle-cmv质粒，BJ5183、 DH5α大肠杆菌，PmeI酶购自Qbiogene公司；携带p53基因的质粒由马延高教授惠赠；PacI酶购自Neix、DL2000Marker购自TaKaPa公司；λDNA·HindⅢMarker购自Promega公司；其他分子生物学工具酶购自MBI公司。 1.2 重组转移质粒的构建 设计扩增p53基因的上下游引物分别为： p53-up:5 atg tct cga gat gga gga gcc gca gtc aga 3 （30bp）， p53-doin;94℃30s、56℃30s、72℃50s，共30个循环；72℃延伸10min。用XhoI和HindⅢ酶切PCR产物，琼脂糖凝胶电泳回收，连接到同样经XhoI和HindⅢ酶切回收的pshuttle-cmv转移质粒中；转化DH5α感受态菌，卡那霉素抗性平板筛选。 1.3 重组转移质粒的鉴定 挑选卡那霉素抗性平板筛选菌落培养，碱裂解法提取质粒，用XhoI和HindⅢ酶切鉴定，并以能酶切出与目的基因片段大小相符的质粒为模板，用上述引物进行PCR鉴定。得到的重组转移质粒命名为psh-p53。再用上述引物由上海生工公司测定psh-p53中目的基因片段