糖尿病病人突变CD59蛋白在真核细胞中的表达论文.docVIP

　　糖尿病病人突变CD59蛋白在真核细胞中的表达论文 【摘要】 目的 构建两种含有人CD59蛋白突变体的真核表达载体，获得中国仓鼠卵巢(CHO)细胞真核表达系统，为在基因水平阐明糖尿病血管增殖性病变的发病机制奠定基础。方法 将两种含有不同突变体的人CD59全长cDNA序列重组pALTER质粒，应用阳离子脂质体导入法与pcDNA共转染CHO细胞，用G418筛选阳性克隆，应用细胞免疫组化及流式细胞仪检测CD59在CHO细胞表面的表达。 结果 含有人CD59两种突变体的重组pLATER质粒经酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到长496 bp的电泳条带，与所插入片段完全相符。运用阳离子脂质体导入法将重组pALTER质粒共转染CHO细胞成功.freelan mutant CD59 and obtain Chinese hamster ovary (CHO) cell eukaryotic expression system, so as to interpret the mechanism of vascular proliferation in diabetes. Methods pALTER plasmid containing tutant CD59 cDNAs e. The positive clones embrane munohistochemistry and floetry. Results pALTER plasmid containing CD59 es and a 496 bp fragment obtained by electrophoresis, ity id munohistologically. It ance expressions of eukaryotic system of human mutant CD59 cDNA akes further study of mutant CD59 glycation and antiplement activity possible, and thus elucidate the mechanism of blood vessel proliferation in diabetes. KEY utation; CHO cells; Transfection; Antiplement activity 文献报道，人糖尿病血管增殖性病变的发生与CD59糖基化失活有关1。与动物不同，人CD59具有独特的糖基化位点K41～H44，已证实K41(赖氨酸)的糖基化可损害CD59的活性。因此，我们认为糖尿病病人体内可能存在易于糖基化的突变CD59分子。为了探讨人突变CD59的抗补体活性及其与糖尿病血管并发症之间的关系，本研究拟采用PCR定点诱变法获得糖基化位点改变的目的CD59突变基因，将其转染CHO细胞，获得阳性表达克隆，为从基因水平探讨糖尿病血管增殖性病变的发病机制奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 大肠杆菌DH5α由本室保存。CHO细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所。含人突变CD59 cDNA重组pALTERMAX载体(HM7、HM8)由高美华教授在美国哈佛大学制备。pcDNA3 质粒购自美国Invitrogen公司。EcoRI、 DNA marker DL 2000购自宝生物工程(大连)有限公司。F12培养液、RPMI1640购自Hyclone公司。2.5 g/L的胰蛋白酶、G418购自Amresco公司，CD59FITC、荧光抗体鼠(MOUSE)IgG2aFITC购自COULTER公司。辣根酶标记兔抗山羊IgG(H+L)购自北京中山生物技术有限公司。抗CD59(N20)抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司。 1.2 扩增含人突变CD59 cDNA重组HM7、HM8质粒 HM7、HM8质粒分别转化大肠杆菌DH5α后经氨苄青霉素筛选，均参照《分子克隆》方法提取质粒。提取的质粒用EcoRⅠ酶切鉴定，得到含有目的基因片段的重组质粒。行DNA序列分析。 1.3 重组质粒转染CHO细胞 运用阳离子脂质体介导pcDNA3、pALTER质粒共转染CHO细胞。转化前1 d用2.5 g/L的胰蛋白酶消化CHO细胞,计数，按每孔1.5×105个细胞接种至24孔培养板。每孔加入不含抗生素的F12培养液0.5 mL,使转化当天细胞长满单层。分别取HM7pALTER、HM8pALTER、pALTER质粒各2 μL分别入3个转化管, 每管加入pcDNA3 0.8 μL,稀释于50 μL不含牛血清及抗生素的F12培养液中，标记为A管。分别在3个空转化管中加入2.5 μL的Lipfectamine 2000,.f