肺癌患者PTEN基因启动子甲基化和转录表达的研究论文.docVIP

　　肺癌患者PTEN基因启动子甲基化和转录表达的研究论文 余宗涛 高琼 张吉才 吕军 袁亚莉 【摘要】 目的 探讨张力蛋白同源的磷酸酶基因(PTEN)启动子CpG岛甲基化状态和基因表达水平与肺癌发生的关系。方法 用甲基化特异性PCR检测PTEN启动子CpG岛甲基化状态，实时定量PCR 检测PTEN mRNA的表达水平。结果 在肺癌组织中PTEN基因启动子甲基化的频率为26.67%(12/45)，在肺正常组织中未发生甲基化(χ2=7.448,P 0.01)。正常组织中PTEN mRNA全部表达，肺癌组织中表达缺失率为22.22%(10/45)，且表达量低于正常肺组织(t=-14.156,P 0.001)，不同年龄、性别、肿瘤大小、恶性程度、肿瘤分类中其表达量无显著性差异(P 0.05);PTEN甲基化与其mRNA表达下降密切相关。结论 肺癌中PTEN基因启动子甲基化频率明显升高，其表达普遍下调或缺失，提示PTEN启动子甲基可在肺癌发生、发展中起一定作用。 【关键词】 肺癌;PTEN基因;启动子;甲基化;表达 PTEN位于染色体10q2313.freelRNA在肺癌组织、肺正常组织及肿瘤细胞株A549中的表达，以及在A549细胞株采用5AzaCdR处理后PTEN mRNA的表达水平变化，同时观察其启动子甲基化状态，分析基因表达水平与启动子甲基化和肺癌早期诊断、恶性转移及预后评估等的临床关系。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 标本来源 收集湖北省十堰市太和医院2005年3月至2006年2月手术切除肺癌新鲜标本45 例，男28 例，女17例。年龄45～78 岁，平均55.3岁。其中小细胞肺癌(SLLC)8例、非小细胞肺癌(NSCLC)37例，全部标本均经病理证实，连同23 例非癌症肺正常对照组织，-80℃冰箱保存备用。 1.1.2 A549细胞株培养及药物处理 将对数生长期A549细胞制成5×104/ml细胞悬液，5%CO2条件下培养24 h后，分别用5×10-6mol/L和5×10-5mol/L浓度5AzaCdR处理，24 h后弃去药液并重新更换含新鲜培养液的药液，浓度同前。连续作用3 d后弃去药液，用完全培养液继续培养4 d后进行实验。用同体积PBS处理的细胞作为对照组。 1.1.3 主要试剂与仪器 I1640培养基(GIBCO BRL公司);二甲亚砜(DMSO)、对苯二酚和亚硫酸氢钠、5AzaCdR(美国Sigma公司);人肺癌细胞株A549(武汉大学生物保藏中心);PE7000(美国ABI公司) 。 1.1.4 引物合成 PTEN甲基化引物〔3〕：5′TTTTTTTTCGGTTTTTCGAGGC3′，5′CAATCGCGTCCCAACGCCG3′，扩增片段长度为134 bp。PTEN非甲基化引物〔3〕：5′TTTTGAGGTGTTTGGGTTTTTGGT3′，5′ACACAATCACATCCCAACACCA3′，片段长度为124 bp;PTENmRNA引物〔4〕：5′AACCCACCACAGCTAGAACT3′，5′ATACACATAGCGCCTCTGAC3′，片段长度为251 bp。GAPDHmRNA引物〔5〕：5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′，5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′，扩增片段长度为226 bp( 北京赛百盛公司)。 1.2 方法 1.2.1 组织、细胞DNA提取 以经典酚氯仿抽提法提取组织DNA，经紫外260 nm定量后于-80℃保存备用。 1.2.2 组织、细胞RNA提取后立即逆转为cDNA 按Trizol操作说明书提取组织及细胞RNA，提取后溶于无RNA酶的双蒸水中，立即用试剂盒A3500逆转为cDNA，-40℃保存备用。 1.2.3 基因组DNA的磺化修饰 基因组DNA的磺化修饰参照文献〔6〕：取4 μg(总体积为50 μl)基因组DNA，经变性、碱基修饰、脱盐后回收再脱去磺化基团，用预冷酒精沉淀回收。离心干燥后重新溶于50 μl 去离子水中，置-40℃备用。 1.2.4 甲基化特异性聚合酶链反应(MSPCR) PCR反应体系：磺化修饰后的基因组DNA 50～100 ng(3 μl)，10×buffer 3 μl，2 mmol/ L dNTP 3 μl，25 mmol/L氯化镁3 μl，Taq 酶2 U (1 μl)，上下游引物各2 μl(12 pmol)，20倍SYBR Green Ⅰ 0.75 μl，去离子水补齐至30 μl。置PE7000仪进行扩增，95 ℃变性3 min;(95 ℃×60 s，58 ℃×30 s，72 ℃×60 s)×40，在72℃读取荧光值;72℃延伸5 min，同