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实验报告MTT实验一、实验原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm。波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT0.5克，溶于100 mL的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。MTT一般最好现用现配，过滤后放4℃，避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。配制MTT时用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：NaCl 8g＋KCl 0.2g ＋ Na2HPO4 1.44g ＋ KH2PO4 0.24g调pH 7.4，定容1L。二、实验目的1. 利用胶束测试细胞毒性(MTT法)，选择的细胞为：HeLa细胞、L929细胞和HepG2细胞，测试48 h内不同聚合物胶束浓度下细胞的存活率。2. 制备含有负载不同浓度的DOX药物载体，利用MTT法，选择的细胞为：HeLa 细胞、L929细胞和HepG2细胞，测试48 h内负载不同浓度DOX的药物载体细胞的存活率。3. 对于负载药物的DOX药物载体，利用CLSM(共聚焦激光扫描显微镜)，观察在0.5 h, 1 h, 2h, 4 h, 8h细胞中的成像问题。三、实验方法将状态良好的细胞消化，用培养液稀释至3×104cells/mL细胞密度，吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液100 μL，置培养箱中孵育24 h使其贴壁。待细胞贴壁后加药。本实验中药物溶液与胶束制剂的配制和稀释均用培养液，并用0.22 μm滤膜无菌过滤。受试溶液每孔加入100μL，每个浓度3个平行孔；对照组，即不加待测药液，单一补加100μL培养液,置培养箱中和细胞共同畔育。于加药后48、72和96 h，将96孔板取出，每孔加入2 mg/mL MTT溶液50μL，置培养箱中鮮育4 h后甩板，将96孔板倒扣于滤纸上充分吸干残留液体后，每孔加入200μL DMSO于振荡器上振荡10 min以溶解蓝紫色结晶物。设定A1孔(只含有200μLDMSO)为调零孔。使用酶标仪在570 nm处测定各孔调零后的吸光度值。三、配置不同浓度的胶束以及负载不同浓度DOX的药物载体，使终浓度分别为0.1、1、10、100、500μg/mL。精密称取一定质量的聚合物材料，通过透析法或者溶剂挥发法制备聚合物胶束，量取一定量的浓溶液并稀释为一系列浓度的聚合物溶液，用0.22μm无菌滤头过滤除菌后，待用。取处于对数生长期的细胞，适量胰蛋白酶消化后计数，加入适量RPMI1640培养基稀释为细胞浓度为80000个/mL的细胞悬液，于96孔细胞培养板上每孔各接种100 μL稀释好的细胞悬液，即每孔含8000个细胞。培养4h待细胞贴壁60后,各加入l(HiL待测聚合物囊泡溶液,使终浓度分别为0.1、1、10、100、500μg/mL。培养板的最外周孔加200μL PBS，实验室仅使用外周孔之内的孔。且每个浓度均设5个复孔，并设置5个阴性对照孔(无