荧光定量PCR检测痰结核杆菌DNA及其临床应用.pdfVIP

齐齐哈尔医学 院学报 2010年第 31卷第 22期 ·3565 · 荧光定量 PCR检测痰结核杆菌 DNA及其临床应用 金建 东 【摘要】 目的 探讨荧光定量 PCR(FQ—PCR)检测痰 中结核杆 菌DNA 的诊断价值及其临床应 用。方法 对 51例初 步诊 断为肺结核的初治患者 ，2O例 其他肺 病患者痰标本进 行直接 涂片、浓 集涂片 找抗酸杆 菌，痰结核杆菌培养和 FQ—PCR检测 TB—DNA。结果 FQ—PCR法敏感度 最高，与其他三 种检测方法比较差异有统计学意义 (P0．05)。结论 涂片检查结核杆菌应提倡浓集法，FQ—PCR法 检测 TB—DNA应列入 TB实验诊 断的常规 项 目。 【关键词】 痰 结核杆 菌 FQ—PCR 传统结核杆菌检测 ，痰直接涂片抗酸染色计数 阳性率低。 1．5．3 操作按照试剂使用说 明，对待测血清标本 、阴性对照 、 浓集涂片找抗酸杆菌敏感度特异性提高 ，但不理想 。结核杆 阳性对照 、阳性 标 准 品 的 DNA 进行提 取 ，取各 管模 板 加入 菌培养法周期太长 。本研究采用 Taqman荧光定量 聚合酶链 PCR反应管中，按规定 的循环参数进行 PCR反应 。反应结 反应 (PCR)技术 ，检测痰标本结核杆菌 DNA。在 FQ—PCR 束后 ，利用阳性梯度标准 品的循环 阚值 (Ct)值 ，制成标准 曲 检测痰 TB的应用 中，痰标本的留取和前处理将直接影 响检 线 ，再根据样 品的Ct值准确定出起始 DNA的拷 贝数 。 测的灵敏度和结果 的准确性 。本文采用胰酶消化法对痰标本 2 结果 进行处理 ，再行 FQ—PCR检测 ，提高了检 出率使定量结果更 51例肺结核 、2O例其他肺病 患者痰标本直接涂片 、浓集 趋 于准确 。现报告分析如下 。 涂片 、培养、PCR检测结果 ，见表 1。直接涂片与痰浓集涂片 1 材料与方法 比较差异有统计学意义 (P 0．05)；痰浓集涂片与痰培养 比 1．1 一般资料 取 自本院2007年 8月～2O1O年 1月肺 结核 较差异无统计 学意义 (P 0．05)；FQ—PCR与其 他三种检 患者 51例 ，病例人选根据临床症状 、体征及胸部 x线表现初 测方 法比较差异有 统计 学意义 (P 0．05)。 步诊断为肺结核 的初治病人 ；20例其他肺病患者其中细菌性 表 1 51例肺结核 20例其他肺病患者痰标本涂片、培养、PCR检测结果 肺炎 9例 ，慢 阻肺 l1例 ，本组标本涂片未查到结核杆菌 ，临床 无结核证据 ，均未经抗痨治疗 。 1．2 痰标本收集 标本收集前清洗和灭菌处理一批带盖样 本盒 ，交 由护 士并 由病人 自行 留取痰 标本 。嘱 咐要求病 人晨 起后漱 口，深 咳出 1～2口痰入样本盒 ，加盖送检 ，样本应避免 混入唾沫 。涂片镜检应有大量上皮细胞及尘细胞 ，否则重留。 1．3 试 剂和仪 器 胰酶 消化液 ，称取 10g胰酶 溶于 200ml 3 讨论 蒸馏水 ，用 2 NaOH 调 pH 至 8．0，加 25mmol／ICaCI 结核杆菌检测 ，传统的抗酸杆菌涂片染色镜检 ，检 出率 22ml。4。C保存至少 1年 ，另用前 37℃水箱温育 10rain。 低 ，干扰 因素 多，系统及人为引起的误差大。 “金标准”的结核 FQ—PCR试剂盒 由科华公司提供 。仪器 由Roche公 司生产 菌培养 ，需 45天费时过长，要求条件高。FQ—PCR简便快 LightCycler荧光定量分析仪分析 。 捷 ，灵敏度高 ，重复性好 。本研 究应用上述几种方法分别对 1．4 统计学处理 应用 SPSS12．0软件系统 ，组 间 比较采用 51例 已确诊的结核病标本 (包 括菌 阳和菌 阴)进行检测 ，其 阳 t检验 。 性率分别为 21．5 、35．2％、33．3 和 72．5 ，显示 FQ— 1．5 方 法 PCR法在检测结核菌与其他方法