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* * CRISPR–Cas系统 ——基因组编辑新技术 报告人：Sky 2014.7.24 杭州百替生物技术有限公司是国内首家专注于医学科研咨询和技术服务 的公司，我们专业为临床医生提供从方案设计，实验实施，数据分析， 结果处理和报告总结等系列一站式服务。我们拥有三大技术服务中心, 可 为临床医生定制和提供各类医学实验技术服务: 医学分子生物学实验服务 ，细胞生物学实验服务，疾病动物模型实验服务。 百替生物，让科研更 轻松 1. CRISPR概述与应用 2. CRISPR技术操作 3. 与TALEN技术的比较 4. CRISPR应用展望 CRISPR概述与应用 CRISPR-Cas系统是利用一段小RNA来识别并进行有效的靶向DNA剪切，细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。 CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats） 即成簇的、规律间隔的短回文重复序列。 CRISPR概述与应用 CRISPR-Cas系统最主要的靶向要求： PAM（protospacer-adjacent motif）为NGG。 CRISPR概述与应用 CRISPR概述与应用 CRISPR系统是一项靶向基因修饰的革新技术，被誉为DNA“动手术”的外科医生，是极具有可能获得诺贝尔奖的技术。 Now you can essentially change a genome at will to almost anything you want. The skys the limit. — Craig. Mello CRISPR概述与应用 将trancrRNA和crRNA可以合并为一个可识别基因组上特定基因座的guide RNA，并将guide RNA与Cas 9一起导入到靶基因组中，从而对靶基因组特定基因位点进行切割，利用HR修复，可获得精确突变的突变体。 CRISPR概述与应用 小鼠模型的构建：CRISPR技术不需要ES细胞，只需3-4周快速有效地获得多个基因双拷贝均有突变的小鼠。 CRISPR概述与应用 2014年1月30日发表在Cell期刊“Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos”，中国科学家首次在猴子体内利用一种高效且可靠的CRISPR/Cas9系统的方法实现精确的基因修饰。 CRISPR概述与应用 2013年1月29日在《nature biotechnology》上，作者利用CRISPR-Cas系统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向修饰。 2013年1月29日在《nature biotechnology》上，作者利用人工合成的sgRNAs能指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰。 2013年2月15日在《science》上，作者利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的crRNA实现了同时对两个基因进行编辑。 2013年7月25日在《Nature Methods》上，作者介绍了他们激活的多个与多种人类疾病相关的基因，包括与肌肉细胞分化、肿瘤与炎症，以及胎儿血红蛋白生成作用相关的基因。作者还介绍利用CRISPR技术对这些基因进行改造，可以治疗镰状细胞贫血、关节炎等多种疾病。 2014年1月30日在《Cell》上，中国科学家首次在猴子体内利用一种高效且可靠的CRISPR/Cas9系统的方法实现精确的基因修饰。 许多美国CRISPR技术的先驱已经开始了人类应用的筹备工作。 CRISPR技术操作 利用 Cas9 质粒建立 knock-out 细胞系实验的详细过程: 1. 确定待敲除基因的靶位点 2. 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo（引物） 3. 构建表达gRNA的质粒 4. gRNA活性检测(SSA检测） 5. 利用Cas9质粒建立knock-out细胞系 CRISPR技术操作 利用Cas9质粒建立可遗传的基因敲除动物品系的详细实验过程： 1. 确定待敲除基因的靶位点 2. 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo（引物） 3. 构建可表达gRNA的Cas9质粒 4. 体外转录gRNA 和Cas9 RNA 5. 将gRNA和Ca