Chapter 12 DNA 重组技术(B).pptVIP

基因克隆的基本步骤：１、 获得待克隆的DNA片段（基因）；２、 目的基因与载体在体外连接；３、 重组DNA分子导入宿主细胞；４、 筛选、鉴定阳性重组子；５、 重组子的扩增与／或表达。 一、目的DNA片段的获得 从mRNA合成cDNA：逆转录酶 PCR 人工合成 从基因文库中筛选： 基因组文库、 cDNA 文库 PCR技术的发明 1983年, Mullis发明了PCR技术 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 （一）原理 在微量离心管中, 加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物, 通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环, 每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍, 一般样品是经过30次循环, 最终使基因放大了数百万倍 。 PCR产物是介于引物的5’端之间的双链DNA片段。 （二）反应体系： 模板（template） 引物（primers） Taq DNA 聚合酶 dNTP 反应缓冲液（Mg2+） 1、Taq DNA聚合酶 是一种耐热的DNA聚合酶 离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较 敏感。最适浓度为50mmol/L。 忠实性:没有校正单核苷酸错配功能--致命弱点。一般出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意。 用量：一般为0.5-2.5U，过多易造成非特异性扩增，过少可能灵敏度不够。 引物是PCR特异性反应的关键 2、引物的设计 ① 引物长度一般15-30 nt，过短则特异性低；② 避免内部形成二级结构；③ G/C和A/T碱基均匀分布，G/C含量在45%- 55% 之间；④ 两个引物（特别是3’端）间不能发生互补， 以免形成引物引物二聚体； ⑤ 引物的3’-端碱基一般应与模板严格配对，并且3’端为G、C或T时引发效率较高 ⑥ 引物的5’-端可添加与模板无关的序列（如限制性内切酶的识别位点、ATG起始密码子等） 注：引物3’端决定引物的特异性 第一步 加热变性 第二步 退火 第三步 延伸 第1个 PCR 循环完成后得到两个拷贝的靶序列 (三)PCR循环参数1、预变性（Initial denaturation）．模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。2、引物退火（Primer annealing） 退火温度可参照Tm=2（A+T）+4（G+C） 一般需要凭实验（经验）决定。退火温度对PCR的特异性有较大影响。3、延伸延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。延伸时间随扩增片段长短而定。 4、循环中的变性步骤循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：5、循环数大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。6、最后延伸在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使延伸完全，并使单链产物退火成双链。 （一）逆转录PCR（Reverse transcription－PCR, RT-PCR）RNA经逆转录后可作为模板进行PCR. RT－PCR常用于基因表达研究（定量PCR） （二）多重PCR（Multiple PCR）在同一PCR反应体系中用多对引物（覆盖不同长度的靶序列）同时扩增。 (三) 套式PCR（nested PCR）用第一次PCR扩增区域内部的第二对（套式）引物对第一次PCR产物再次扩增,可以增加特异性和灵敏度。 (四) 非对称PCR（asymmetric PCR） 目的：扩增产生特异长度的单链DNA 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物, 其最佳比例一般是0.01∶0.5μM, 关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 (五) 反向PCR(reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段 应用: 1) 可对未知序列扩增后进行分析, 如探索邻接已知DNA片段的序列； 2) 用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆, 扩增基因文库的插入DNA； 3) 建立基因组步移文库。 操作 1、选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切， 2、然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接， 3、再用一对反向的引物进行PCR (六) 原位PCR 原位PCR（In Still PCR,Is－PCR）是由H