rapigest sf表面活性剂：用于溶液中酶蛋白消化的工具.docVIP

RapiGest SF试剂：促进溶液中蛋白酶解的有利工具 Ying Qing Yu与Martin Gilar 美国马萨诸塞州米尔福德沃特世公司  简介 本应用纪要中，我们介绍了沃特世专利RapiGest? SF试剂的物理化学性质及其应用领域。2002年，我们首次推出RapiGest SF，这一创新产品是帮助酶消解的有利工具，可促进溶液中蛋白的消解，它能够改善样品制备过程中蛋白的溶解度。 RapiGest SF提高酶解速率与完全程度的机理详见图1。温和的蛋白变性可打开蛋白结构并暴露酶切位点，以供酶切。在RapiGest SF溶液中，酶对变性的耐受性优于普通蛋白，并能保持活性。在加入酶之前高温加热RapiGest SF溶液可使球蛋白更为完全变性，之后需将酶与样品一起进行37 °C的孵育。1,2 超过200多家行业内杂志引用了使用RapiGest SF进行样品溶解的案例，大部分为蛋白组学的应用。最近，许多制药实验室使用RapiGest SF用于蛋白药物的确证。因为酶消化的速度的提高并在LC、MS分析前极易清除，RapiGest SF已被多个应用领域广泛接受，其中包括高级序列研究的LC/UV/MS蛋白药物的肽图分析。  讨论 什么是RapiGest SF? RapiGest SF是酸性不稳定表面活性剂，在酸性条件下极易水解。1这种独特的性质，在需要的时候，可用于从溶液中清除表面活性剂。RapiGest SF的结构及其水解副产物见图2。酸性不稳定的性质可在pH2条件下，45分钟内达到完全降解。1 该表面活性剂可降解为两个产物：dodeca-2-one和3-（2,3-）HPLC、LC/MS或MALDI-TOF MS进行分析。 消解后的清除 样品分析前无需额外去清除表面活性剂（如透析）。在分析前，酶消解后通常经过酸（如甲酸、三氟乙酸（TFA）（HCl）RapiGest SF。建议降解条件pH ≤ 2。  胰蛋白酶消解的兼容性 胰蛋白酶是最常见的蛋白水解酶，可用于肽图分析和蛋白组学的应用。我们研究了在添加RapiGest SF的情况下胰蛋白酶的活性作用，并与文献中最常见的变性剂的作用做了对比。本检测基于胰蛋白酶诱导N-α-苯甲酰-L-精氨酸乙基乙酯（BAEE）50 mM重碳酸胺（pH 7.9）UV 253 nm下测量BAEE水解率进行计算。在选择的变性溶液中，胰蛋白酶活性与对照样品进行对比（非变性剂）。结果见于表1。  表1中的数据说明低浓度下（0.1%） RapiGest SF 本实验说明蛋白酶的活性受到蛋白溶液中所用变性剂的影响。RapiGest SF在从低到高的浓度下均不改变酶活性，因此，最佳的蛋白消解条件是无需过量酶即可达到酶解的结果。 快速蛋白消解 对蛋白酶解存在抗性的蛋白使用RapiGest SF试剂，可在数分钟内消解完全。完全消解球蛋白、马肌红蛋白只需要5分钟内即可完成。该试剂辅助的消解结果与对照见图3。由于肌红蛋白是球蛋白，众所周知，若没有表面活性剂将难以消解。在对照反应中，与胰蛋白酶孵育9小时后只有少量的蛋白可以消化。使用了RapiGest SF试剂，总体的消解的效率显著提升。  在蛋白药物肽图中的序列覆盖范围更大 RapiGest SF在蛋白组学的样品前处理中广泛使用，是有效的蛋白溶解变性剂。最近越来越多的生物制药实验室在肽图分析中采用了RapiGest SF。一些发表的论文记录了使用RapiGest SF进行蛋白药物消解的优势。4,5经报导的RapiGest SF浓度范围为0.05 -1%，取决于蛋白疏水性与浓度。 我们发现浓度范围为0.05 -1%的RapiGest SF足以使各种大小的蛋白变性，高浓度RapiGest SF适合全细胞蛋白提取的实验。 单抗（mAbs）（PTMs）RapiGest SF辅助的人单抗消解的实例。样品制备与分析的参数以UPLC?和四级杆Tof质谱分析的参数已列表作为指导。  图4显示实验中总序列覆盖率为98%。数据分析通过BiopharmaLynx? v.1.2软件得到。高序列覆盖率（98%）LC/MS分析中没有发现错误酶切的多肽或完整未被酶切的蛋白。剩下的2%未确认的序列为少数二个氨基酸的肽或单个氨基酸（RK） 样品制备 人单抗样品（10 μL, 21 mg/mL）0.1% （w/v） RapiGest SF 50 μL 50 mM重碳酸铵中溶解。将2 μL 0.1 M的二流苏糖醇（DTT）50 °C加热30分钟，加入4 μL 0.1 M的碘代乙酰胺，在样品冷却至室温后样品在黑暗中静至40分钟。  人化单抗IgG多肽图谱 蛋白序列覆盖率= 98%  样品中加入8 μg胰蛋白酶（胰蛋白酶浓度= 1 μg/μL），样品在37 °C孵育过夜。消解样品与1%甲酸与10%乙腈混合（