第八章 RNase-Free DNase Set中文操作手册.pdfVIP

DNase I stock solution 配置： 请勿打开DNase I 管盖，用针头吸550 μL RNase-free water (1.5 mL 管装 中提供)，注射入DNase I，并正反倒置混匀溶液。切勿涡旋震荡！视试验 习惯和计划，将配置好的DNase I stock solution 分装至大小合适的离心管 或PCR 管。保存于-20℃，可保证效期9 个月。可在2-8℃ 保持效期6 周。 不可反复冻融。因此建议分装后-20℃保存，尽量一次用完，如果不能一次 用完，请即保存于2-8℃，6 周内用完 一．在溶液中进行DNA 消化的方法： E1.将下列东西加入离心管中混合： ≤87.5 μl 的RNA 溶液 10 μl Buffer RDD 2.5 μl DNase I stock solution 用RNase-free water 将最终体积调节到100uL，如果觉得需要也可以将所 有反应体系加倍（共200uL） E2.在工作台上(20–25°C)孵育10 分钟。 E3. RNA Cleanup （注意：可处理的RNA 量不超过100ug） 1. 将350uL Buffer RLT 加入到上述100uL 溶液中，混合均匀。 2. 再加入250 μl 乙醇(96– 100%) ，用吹打的方式进行混匀，不要离心，立 即进行第三步。 3. 将这700uL 溶液转移至一个RNeasy Mini spin column 中，下面放置2 ml 收集管(试剂盒提供)。盖紧盖子，≥8000 x g (≥10,000 rpm) 离心15 s ， 弃废液。收集管可以在第4 步中重新使用。 注意：离心后要将柱子小心的从收集管中取出，不要碰到下面的废液。并且 确保收集管完全风干。 4. 将500 μl Buffer RPE 加到RNeasy spin column 上。盖紧盖子，≥8000 x g (≥10,000 rpm) 离心15 s 以洗涤柱膜。弃废液。收集管可以留着在第5 步重新使用。 注意：试剂盒提供的 Buffer RPE 是浓缩液. 确保使用使用之前已加入乙醇。 （加入4 倍体积的96%-100%乙醇） 5. 将500 μl Buffer RPE 加到RNeasy spin column。盖紧盖子，≥8000 x g (≥10,000 rpm) 离心2min 以洗涤柱膜。长时间离心的目的是确保柱子干燥， RNA 洗脱时没有乙醇残留。乙醇残留会影响下游应用。 注意：离心后要将柱子小心的从收集管中取出，不要碰到下面的废液。否则 可能会有乙醇交叉污染。 6. 可选: 为防止还有Buffer RPE 以及别的成分残留或污染，可将柱子置于 一个新的离心管再以最高速离心1min。 7.将柱子置于一个新的1.5 ml 离心管 （试剂盒提供)。直接将 30–50 μl RNase-free water 加到柱膜上。盖紧盖子，≥8000 x g (≥10,000 rpm) 离心1min 以洗脱RNA。 8. 如果期望得到30 μg 产量的RNA, 另加30–50 μl RNase free Water，重复第7 步。如果期望更高浓度，可将第 7 步的洗脱液再过柱离心。 但是后者产量会比前者低15-30% 。 二、柱上DNA 消化的方法： 对于共提：AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Handbook 第32 页进行完第7 步后，第8 步用用下面的步骤取代： E1. 将350 μl Buffer RW1 加入到RNeasy spin column, ≥8000 x g (≥10,000 rpm) 离心15 s 以洗涤柱膜。弃废液。收集管可以留着在E4 步骤 时使用。 E2.将10 μl DNase I stock solution 加到70uL Buffer RDD （试剂盒提供） 中。上下颠倒离心管混合均匀，简单离心以收集壁上残留液滴。 注意：DNase I 对物理剪切非常敏感，混合时只能轻柔地上下颠倒，切不可 漩涡混合。 E3.直接将80uL DNase I 预混液加到柱膜上，置于工作台上(20– 30°C)15min。 注意：务必将DNase I 预混液加到柱膜上，如果有部分预混液黏附在柱子 的O 形环上将会造成DNA 消化不完全。 E4. 将350 μl Buffer RW1 加到柱上，≥8000 x g (≥10,000 rpm) 离心15 s。 弃废液。按照AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Handbook