第十一章 PPL慢病毒使用手册.pdfVIP

Public Protein/Plasmid Library PPL 慢病毒使用手册 目 录 1. 慢病毒保存和使用 2. 慢病毒操作安全提示 3. 慢病毒滴度测定 4. 慢病毒感染靶细胞操作流程 5. 常见问题及解决方案 6. 附件材料 Public Protein/Plasmid Library Email: protein@ Tel: 0086-025 Public Protein/Plasmid Library 1 慢病毒保存和使用 1.1 慢病毒保存 PPL提供已经分装的慢病毒可在-80 °C条件下保存 6 个月，滴度不会出现明显下降 ， 但如果保存时间超过6~ 12月，滴度可能降至原来十分一，使用前请重新测病毒滴度。病毒液 200 µl/管 ，共5管。 慢病毒产品应避免反复冻融，冻融一次病毒滴度会下降 20~50% 以上，甚至更多。建议 不要在-20°C下长期保存慢病毒；如果冻融后需于短期内 （一周以内）使用，建议置于 4 °C 保存；若在4 °C保存超过一周，病毒滴度会下降 5 倍以上。 1.2 慢病毒的使用 冰上溶解-80 °C取出的慢病毒。如需稀释病毒，可加入适当比例的 PBS （PH7.4 ）或培 养基 （ph7.2 ），混匀分装后 4 °C保存，并最好当天用完。操作时 用枪头吸取慢病毒时，应 尽量避免慢病毒暴露于空气 中，避免起泡。 2 慢病毒操作安全提示 PPL提供的慢病毒为经过一系列遗传改造的“ 自杀”性假型病毒，病毒毒性基因被剔除 并被插入目的基因，病毒感染目的细胞不再产生具感染性子代病毒颗粒，最大限度保证实 验安全性。 PPL建议不要构建编码病毒基因的慢病毒载体，建议不要构建携带编码可能致癌基 因的假型病毒进行生物学实验。 请在生物安全 II 级环境下包装和使用慢病毒，操作时请穿实验服，带口罩和手套。 实验结束后立即用肥皂和水清洗双手。 如需要离心，应使用密封性好的离心管，或者用 Parafilm 膜封口后离心，而且尽量 使用组织或细胞培养室内的离心机。 含病毒的废弃培养基应加入消毒液浸泡 一 天后再予以丢弃。接触过病毒的枪头、 离心管、培养板等其他物品可用 消毒液稀释液处理，也可以用煮沸半小时处理或常规灭 菌 （121°C，20 min ）处理。 3 慢病毒滴度测定 请参见病毒包装报告的病毒滴度测定部分。 4 慢病毒感染靶细胞操作流程 4.1 注意事项 A ．测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞 （如HEK293T ，Hela等）作为平行实验的阳性对照细胞。 Public Protein/Plasmid Library Email: protein@ Tel: 0086-025 Public Protein/Plasmid Library B ．在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上， 含有血清、双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。 C ．PPL提供的病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如： 病毒滴度为1×10^8 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1×10^8个具有生物活性的慢病毒颗 粒。 4.2 感染贴壁细胞 以24孔培养板培养的Hela感染实验为例。实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔， 并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可对病毒原液进行稀释。如果您要 感染的细胞为首次使用，建议您设定一个病毒感染的MOI范围（例如：0、5、10、20 ）以 便测定最适合表达目的基因的MOI值。 Day 1 准备感染靶细胞：24孔培养板，每个孔接种3~5×10^4个靶细胞，每孔培养液300 μl 。