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安徽铜陵白姜姜瘟病病原鉴定 　　摘 要：通过田间调查发现，铜陵白姜姜瘟病在铜陵当地表现出木质部黄心和黑心2种症状，通过TTC平板分离、致病性测定、16S rDNA以及青枯菌特异性鞭毛基因（fliC）检测表明，导致2种不同姜瘟病症状的病原菌均为青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum），但二者致病性存在明显差异 关键词：铜陵；白姜；姜瘟病；青枯雷尔氏菌；病原鉴定 中图分类号：S632.5 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2016）24-0075-04 由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum，简称青枯菌）侵染造成的细菌性青枯病是世界性重要病害之一，该菌可侵染54个科的450多种植物[1]，但以茄科作物，如番茄、马铃薯等，受害最为严重。生姜青枯病，因其发病快、死亡率高、无有效防治手段，所以俗称姜瘟病[2]。安徽铜陵白姜种植历史悠久，姜块色白鲜嫩汁多、香味纯正、品质优良，并具药用价值，宋朝时被列为朝廷贡品，被誉为铜陵“八宝”之一。铜陵白姜种植面积约为400 hm2，年产量约为4 000 t，年产值近亿元，是当地重要的特色农业产业[3]。铜陵市义安区是铜陵白姜主产区，近年来该区姜瘟病的发生日益严重，连作田发病率50%以上，重病田甚至绝收，已经严重阻碍了当地生姜产业的可持续发展[3]。尽管对姜瘟病的研究进行多年，然而对铜陵姜瘟病病原的研究甚少。为此，开展了铜陵白姜姜瘟病病原检测的研究，以期为进一步有效防治该病提供科学依据 1 材料与方法 1.1 样品收集 2016年5～8月，在铜陵市义安区兴化村等主要白姜产区分别挖取叶部呈现萎蔫状的生姜姜块，用清水将其表面泥土冲洗干净，吸水纸吸干，冰盒保存带回实验室 1.2 病原菌分离 病原菌分离均于采样后48 h内在超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司，型号A2）上完成。样品先用无菌水冲洗3遍，晾干至表面无明显水滴，在75%的酒精中浸泡2～3 min，再用无菌水冲洗3遍，晾干至表面无明显水滴，用消毒刀片在姜块中部表面切一道长2～4 cm、深约2 mm的切口，用消毒镊子将其掰开，并用消毒牙签蘸取姜块中间部位汁液，在TTC平板上划线分离[4]。将分离平板置 于28℃培养箱培养24～72 h，所得单菌落超低温 （-80℃）保存于25%甘油管中 1.3 致病性测定 病原菌制备：将病原分离物，接种于SPA液体培养基[5]，摇床（北京东联哈尔仪器制造有限公司，型号DLHR-Q200）发酵48 h（28℃，150 r/min）后，将分光光度计（上海光学仪器721型）OD560值调至1.0，测定菌液浓度约为1×108 CFU/mL，备用 将温室生长至5～8叶的铜陵白姜植株从营养钵中取出，用清水将根部冲洗干净，用消毒针在茎基部刺3个深度和间隔均约为1 cm的针孔，而后将根系置入病原菌发酵液中浸泡20 min。无菌水处理作为对照。每处理5株，重复2次。处理后的植株立即种植于营养钵中，置于人工气候箱（光周期 12 h/8 h，温度30℃，湿度85%）内培养7～10 d 1.4 16S rDNA检测 纯化后的病原分离物直接用PCR扩增，采用16S rDNA通用引物对（F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’），PCR反应体系（50 μL）：2×ES Taq Mix 25μL，正反引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 22 μL。反应条件：95℃ 1 min，95℃ 30 s，58℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30个循环，72℃ 5 min。引物合成和PCR产物测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供 1.5 青枯菌鞭毛基因（fliC）基因检测 根据NCBI中青枯菌鞭毛基因（fliC）序列设计引物对（F：5’-GAACGCCAACGGTGCGAACT-3’，R：5’-GGCGGCCTTCAGGGAGGTC-3’）。反应体系和条件同1.4 1.6 进化树分析 进化树分析在MEGA 7.0中完成。首先，采用Clustalw进行DNA序列比对（DNA Weight Matrix：IUB，其他采用默认参数）。进化树的构建采用Maxium Likehood方法、Tamura-Nei模式 2 结果与分析 2.1 姜瘟病田间症状 在铜陵义安村田间调查表明，感染植株在患病初期，叶片褪绿，叶尖和叶缘先黄化，逐渐萎缩反卷下垂（图1A、B），病叶逐步从基部向上发展，至全株枯死。病株茎基部逐渐变软，维管束变色褐化、呈水渍状，挤压时，有污白色菌脓流出。患病姜块变软、维管束变色，根据维管束颜色