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* * * * * * * * * * 前 奏 Ta俩像么 磷酸 脱氧核糖 碱基 脱氧核苷酸 组成4种不同的脱氧核苷酸分子 （dNTP:dATP、dTTP、dGTP、dCTP) 热 身 DNA复制原则 碱基互补配对 半保留复制 母链 子链 热 身 PCR技术 1 概念 2 原理 3 元素 4 过程 5 特点 情 节 特点 定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域(靶基因)扩增出来的技术。 原理 元素 过程 概念 PCR原理： 与DNA的复制原则相同，在微量模板DNA（即靶基因）的存在下，加入适量的缓冲液, dNTP，DNA聚合酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和适温延伸的反应过程,完成特定基因（即靶基因）的体外复制。 特点 原理 元素 过程 概念 碱基互补配对 半保留复制 特点 原理 元素 过程 概念 模板 单链 /双链DNA 裂解细胞壁，使其基因组释放到裂解液中 单链DNA 超声波破碎-急热骤冷联合法 特点 原理 元素 过程 概念 模板 PCR特异性反应的关键 引物 设计原则： 引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。 ① 长度：至少 16bp ，通常为 18-30bp。 ② 引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5℃ 。 ③ G+C 含量：尽量控制在 40% 至 60% 之间⑤ 引物的 3 末端最好是 G 或 C ，但不要 GC 连排。 通用引物16S1、16S2（各20bp） 特点 原理 元素 过程 概念 模板 酶——Taq DNA聚合酶 引物 酶 此酶具有以下特点： ①耐高温 ②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后 再加新酶。 ③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。 PCR反应需酶量： 2.5 U 特点 原理 元素 过程 概念 模板 dNTP（脱氧核苷酸） 引物 酶 底物 等摩尔浓度 终浓度一般为 200mM（即饱和浓度） 勿反复冻融：小量分装， -20℃冰冻保存 特点 原理 元素 过程 概念 模板 缓冲液（10×PCR buffer） 引物 酶 提供合适的pH（7.0~7.5） 提供Mg2+ 激活酶的活性 底物 缓冲液 Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/l为宜 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性 ① 模板：单链或双链DNA ② 引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 ③ DNA聚合酶：耐热的Taq DNA聚合酶 ④ 底物：四种脱氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP) ⑤ 缓冲液： DNA聚合酶的激活剂 PCR基本元素 特点 原理 元素 过程 概念 ① 94℃变性 ② 55℃退火 ③72℃延伸 PCR反应中心过程： 20-40个PCR循环 1个PCR 循环 特点 原理 元素 过程 概念 5 5 3 3 ⑴94℃ 5 ’ 预变性（使模板DNA充分变性） ⑵94℃ 30’’ 变性（时间取决于模板中GC的含量） ⑶55℃ 30’’ 退火（温度由引物的Tm值决定） ⑷72℃ 1.5’ (按1’扩增1kb计算）延伸 ⑹72℃ 10’ 总的延伸（使产物延伸完整） ⑺4℃ 30 ’ 保存 （5） 30个循环 特点 原理 元素 过程 概念 PCR反应程序： PCR原理： 与DNA的复制原则相同，在微量模板DNA（即靶基因）的存在下，加入适量的缓冲液, dNTP，DNA聚合酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和适温延伸的反应过程,完成特定基因（即靶基因）的体外复制。 特点 原理 元素 过程 概念 1）高灵敏度 特点 原理 元素 过程 概念 30轮循环 扩增量达230个拷贝（109拷贝） PCR产物每轮循环增加一倍 2）强特异性 特点 原理 元素 过程 概念 引物 引物 决定因素： 引物与模板DNA特异性的结合； 碱基配对原则； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。 3）低纯度模板 4）快速简便 1）高灵敏度 琼脂糖凝胶电泳 插 曲 如何检查PCR产物的特异性？ 电泳法 酶切法 分子杂交法 核酸序列分析法 琼脂糖电泳