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CRISPR流程设计靶组分并使用CRISPR设计工具 1d输入目标基因组DNA序列我们提供在线CRISPR设计工具() 可以输入序列（例如，来自目的区域的一个1KB基因片段），识别和排列合适的靶位点，计算预测每个指定靶标的off-target位点。或者，可以通过确认任何5’-NGG直接上游的20-bp序列手动选择引导序列。用在线工具确定，订购需要的oligos和引物。如果手动确定分裂位点，oligos或引物应该按照fig4b.c设计。设计ssODN模板（任选） 1h设计和订购定做的ssODN。购买直接来自IDT或首选供应商的正义或反义ssODN的其中一个。我们推荐手动设计每侧至少40nt的同源臂，90nt可以得到最佳HDR效率。PAGE纯化ssODN不是必要的。重新溶解和稀释ssODN ultramers到终浓度10uM。不要使正义和反义ssODNs结合或退火。储存在-20°。准备sgRNA表达结构为了构建sgRNA表达结构，使用PCR表达cassette（选项A）或以质粒为基础的步骤（选项B）通过PCR扩增构建sgRNA表达结构 2h（i）准备稀释的U6 PCR模板。我们推荐使用pSpCas9（BB）或pSpCas9n（BB）（spl.2）作为PCR模板，但任何包含U6的质粒都可以使用。用ddH2O稀释模板到10ng/ul。注意，如果一个质粒或cassette已经包含一个U6驱动