流式细胞仪的参数.ppt

章晓联 教授 武汉大学医学院免疫学系 二 样品的制备和数据的收集 流式细胞仪分析的细胞需要是单细胞悬浮液, 凝集或块状的细胞不适宜流式细胞仪的使用。 全血或Ficoll-Hypaque分离的单核细胞, 用标记的单抗染色, 裂解红细胞 然后在流式细胞仪上, 通过包被细胞的液流的鞘液进行分析。 流 路 单细胞悬液 大多数仪器是在50-300 μm 大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中 这一过程,成为流体动力学聚焦 FLOW CELL 3-D Histograms 4.临床疾病的诊断及治疗依据 （3）补偿对照（双色或多色分析时） 荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectral overlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。需要将单种荧光素标记的单克隆抗体分别进行单色荧光染色，几色分析就需要制备几个补偿对照管 选择荧光抗体 常用的多色组合： FITC＋PE：最常用的双色组合; FITC＋PE＋PE-Cy5：最常用的三色组合，进行多色荧光染色时荧光光谱重叠补偿很小; FITC＋PE＋PerCP+APC：最常用的四色组合. 一般PE和APC用于检测表达较低的抗原上，而FITC和PerCP用于检测表达较高的抗原上。 Schematic representation of the Annexin V assay ? FCM分析细胞周期和凋亡: 根据细胞DNA含量的改变 凋亡细胞DNA的降解,凋亡的细胞因核酸内切酶的活性增强，使DNA分裂成一些小片段，这些小片段因细胞膜的通透性的增加而漏出胞外，使凋亡细胞的DNA含量相对减少，与荧光染料的结合减少,故细胞DNA荧光强度降低;DNA直方图上显示在G0/G1峰前出现一个DNA含量减少的亚二倍体或称亚G0/G1峰, 又称凋亡峰.通过DNA含量可同时研究凋亡细胞的周期特异性。 利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等) 与细胞内DNA碱基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量. 细胞DNA分析原理 细胞周期与DNA的倍体关系 G2 M G0 G1 s 0 200 400 600 800 1000 G0 G1 s G2 M DNA Analysis DNA content Count 2N 4N Normal Cell Cycle (2) 机体免疫功能监测的应用例子： 自身免疫性疾病HLA-B27:强直性脊 柱炎相关标志 变态反应性疾病CD23: 与变态反应严重程度呈正相关 FCM在血液, 肿瘤学中的应用; 如白血病, 淋巴细胞瘤的诊断和分类, 肿瘤的监控; 在药理学中的应用. (3) 器官移植后免疫监测 提示排异------- CD3+/CD25+基线5-10%以上 提示肾穿------- CD3+/CD25+持续增加 预测感染------- CD4/CD8比值下降 指导免疫抑制剂应用-- CD4/CD80.2必须停药 提示MCV感染------CD3+/HLA-DR+增加5-10% 不伴CD25增加 (4) AIDS 诊断及治疗监控 标本的制备 免疫标记（膜表面)的样本处理 保证单细胞悬液：组织标本采用机械法、酶法。 300目尼龙网过滤 调整细胞浓度：2~5X106/ml， 标记：取100ul样本 + 适量抗体 孵育：室温避光20分（或根据抗体说明） （加二抗） 溶血：溶血剂的选择（市售、氯化氨、草酸氨） 检测： 标本的制备 免疫标记（细胞浆内)的样本处理 先将细胞膜“打孔” ----破膜 破膜剂的选择：Triton 皂素 毛地黄毒甙 按前述方法进行标记 标本的制备 细胞周期分析的样本处理 传统方法： 单细胞悬液（如全血，则需分离单个核细胞） 冰乙醇固定过夜 洗涤细胞 加复合染液（Triton，RNA酶、PI） 20--30分钟后上机检测 BC公司DNA-Prep试剂 溶血（如需要） 固定染色一步完成 20分钟后上机检测 FCM对照设置 阳性对照：使用已知阳性样本，帮助排除试剂的质量、浓度、特异性以及染色方法等因素造成的假阴性结果。 阴性对照 （1）空白对照：由于存在自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光，需要设立空白对照来去除自发荧光信号（噪声信号）。 （2）同型阴性对照：就是将